閔志雪， 黃 璐， 孫 瑤， 包鵬舉，2， 王海華，2， 張根葆△

疼痛是腦對急性或慢性組織損傷所引起的傷害性傳入進行抽象和概括后所形成的不愉快感覺，常常伴有復(fù)雜的自主神經(jīng)活動、運動反射、心理和情緒反應(yīng)。藥物是疼痛治療最常用和最基本的方法。目前缺乏作用強、不成癮、可長期安全服用的鎮(zhèn)痛藥。因此鎮(zhèn)痛效果良好而不具成癮性的鎮(zhèn)痛藥的開發(fā)研究一直是疼痛控制的路徑之一。

二十世紀初，人們就開始應(yīng)用蛇毒治療疼痛，與傳統(tǒng)藥物相比，蛇毒鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)痛時間長，無成癮性和耐藥性，用量少，對頑固性疼痛、神經(jīng)性疼痛和癌性疼痛都有效［1］。自發(fā)現(xiàn)粗毒具有鎮(zhèn)痛活性以來，國內(nèi)外分離純化發(fā)現(xiàn)約百余種鎮(zhèn)痛組分，從成分復(fù)雜的粗毒中分離純化尋找可靠的純度較高而效果良好的鎮(zhèn)痛組分，并對其結(jié)構(gòu)性質(zhì)、作用機制進行研究具有重要意義。皖南地區(qū)地處亞熱帶，氣候溫和，丘陵山地偏多，蛇的蘊藏量相當(dāng)豐富。關(guān)于皖南地區(qū)眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛組分尚未見報道，因此對皖南地區(qū)眼鏡蛇毒中鎮(zhèn)痛成分進行研究開發(fā)和應(yīng)用是一個很有價值的研究方向。

材料和方法

1 材料

1.1 主要儀器與試劑 AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(Pharmacia)，pHs-3B型 pH計(上海雷磁儀器廠)，RB智能熱板儀(四川成都儀器廠)，眼鏡蛇毒由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供，P/ACE MDQ高效毛細管電泳液(貝克曼庫爾特公司)，SP Sephadex C-50和Sephadex G-50為Pharmacia產(chǎn)品;透析袋，截留相對分子量3 500(Sigma)，鹽酸嗎啡(morphine chloride)注射液(批號101006-1)購自沈陽第一制藥廠，低分子量標準蛋白購自上海生工公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物 昆明種小鼠244只，體重(20±2)g，由南京青龍山動物繁殖場提供(批號為SCXK蘇2007-0001)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動物實驗符合實驗動物倫理規(guī)定。

2 方法

2.1 眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛因子(cobra venom analgesic factor，CVAF)的分離純化和保存 純化方法參考童富淡等［2］，對皖南地區(qū)眼鏡蛇粗毒使用陽離子交換色譜(cation-exchange chromatography，CEC)和分子排阻層析(size exclusion chromatography，SEC)進行分離純化，取0.5 g眼鏡蛇毒凍干粉對眼鏡蛇粗毒進行預(yù)處理后溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，6 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清0.22 μm 濾膜過濾后備用。平衡后過SP Sephadex C-50陽離子交換色譜，柱規(guī)格為1.7 cm ×40.0 cm，洗脫液0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH=6，流速為1 mL/min，每管6 mL，分段梯度洗脫;測定A280，繪制洗脫曲線，收集各峰洗脫液。使用小鼠熱板法篩選鎮(zhèn)痛活性明顯的組分進行Sephadex G-50純化，柱規(guī)格為1.6 cm×50.0 cm，洗脫液為生理鹽水，流速為 0.5 mL/min，直線洗脫。脫鹽、脫水后將洗脫液配成一定的濃度分裝于凍干管中(每管1 mL)，4℃下放置30 min后，轉(zhuǎn)至－20℃下保存30 min，再置于－80℃中預(yù)凍3 h，最后經(jīng)冷凍干燥機真空凍干24 h。將制成的蛇毒凍干粉于－20℃中密封保存。

2.2 CVAF的純度和相對分子量測定

2.2.1 SDS-PAGE 采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進行十二烷基酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠(T=20%，pH 8.8)和濃縮膠(T=5%，pH 6.8)，以Tris-HCl溶液為緩沖系統(tǒng)，向加樣槽孔中加入20 μL制備好的樣品以及6 μL超低分子量蛋白質(zhì)marker;電泳裝置與電源相連，濃縮膠上所加電壓90 V，當(dāng)染料前沿進入分離膠后，把電壓提至140 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍到達分離膠的底部，關(guān)閉電源;電泳完畢后，小心取出凝膠，置于染色液中染色過夜;染色完畢后，將凝膠置于脫色液中脫色，并輕輕晃動至藍色背景消失為止。凝膠掃描，記錄條帶，計算Rf值，用分子量的對數(shù)作圖，以marker為對照，計算樣品分子量。

2.2.2 毛細管區(qū)帶電泳法(capillary zone electrophoresis，CZE) 電泳分離條件:0.05 mol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液，1 mL樣品(濃度為1 g/L)放入4℃樣品盒中，壓力(20 psi)進樣5 s，毛細管長60.2 cm，有效內(nèi)徑50 cm×75 μm，檢測波長198 nm，運行電壓25 kV，卡盒溫度25℃，運行時間15 min。

2.3 CVAF的鎮(zhèn)痛活性測定

2.3.1 熱板法 選取18～22 g昆明種雌性小鼠50只，基礎(chǔ)痛閾大于5 s小于30 s，測量2次取平均痛閾作為基礎(chǔ)痛閾，按痛閾區(qū)組隨機化分成生理鹽水正常對照組、鹽酸嗎啡陽性對照組和CVAF實驗組(高劑量組、中劑量組和低劑量組)，每組10只。生理鹽水組腹腔注射0.2 mL生理鹽水;鹽酸嗎啡組腹腔注射0.2 mL鹽酸嗎啡(劑量5 mg/kg);CVAF組腹腔注射 0.2 mL CVAF，劑量分別為 0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg。以舔后足為痛反應(yīng)指標，以小鼠痛反應(yīng)時間為痛閾，觀察痛閾變化。痛閾提高率(%)=(給藥后痛閾－給藥前基礎(chǔ)痛閾)/生理鹽水組痛閾×100%。

2.3.2 醋酸扭體法 選取18～22 g昆明種小鼠50只，隨機化分為生理鹽水正常對照組、鹽酸嗎啡陽性對照組和CVAF實驗組(高劑量組、中劑量組和低劑量組)，每組10只。室溫22～26℃。生理鹽水組腹腔注射0.2 mL生理鹽水;鹽酸嗎啡組腹腔注射0.2 mL鹽酸嗎啡(劑量5 mg/kg);CVAF組腹腔注射0.2 mL CVAF，劑量分別為0.03 mg/kg、0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg，1 h 后 ip 0.8%醋酸0.1 mL/10 g，以小鼠腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起、后肢伸長等行為反射稱為完整扭體反應(yīng)1次。觀察15 min以內(nèi)扭體次數(shù)。計算扭體反應(yīng)抑制率。抑制率(%)=(空白組扭體數(shù) －給藥組扭體數(shù))/空白組扭體數(shù) ×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)來表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。

結(jié) 果

1 CVAF的分離純化

經(jīng)SP Sephadex C-50陽離子交換色譜后呈5個峰(圖1)，小鼠熱板法預(yù)實驗結(jié)果顯示第5峰鎮(zhèn)痛活性明顯，取第5峰經(jīng)Sephadex G-50進一步純化，得到3個峰，預(yù)實驗結(jié)果顯示第2峰具有鎮(zhèn)痛活性，收集第2峰洗脫液，裝透析袋，脫鹽、脫水、凍干后呈粉末狀。

Figure 1.Cation-exchange chromatography of crude snake venom on SP Sephadex C-50圖1 粗蛇毒的SP Sephadex C-50陽離子交換色譜圖

2 SDS-PAGE凝膠垂直電泳

結(jié)果顯示CVAF相對分子質(zhì)量為6 500 D，呈單一條帶，見圖2。

Figure 2.SDS-PAGE analysis of CVAF.圖2CVAF的SDS-PAGE凝膠垂直電泳分析

3 毛細管區(qū)帶電泳

結(jié)果顯示CVAF樣品為單峰，與SDS-PAGE凝膠垂直電泳結(jié)果基本一致，見圖3。

Figure 3.Capillary zone electrophoresis analysis of CVAF.圖3 CVAF的毛細管區(qū)帶電泳分析

4 鎮(zhèn)痛活性測定

4.1 熱板法 在小鼠熱板法實驗中測定熱刺激反應(yīng)顯示嗎啡組在給藥0.5 h后達高峰，6 h鎮(zhèn)痛作用消失;0.5 h時0.3 mg/kg CVAF組小鼠痛閾與嗎啡組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF在給藥后痛閾提高百分率分別為9.31%、53.78%和79.23%;2 h時CVAF 0.3 mg/kg組小鼠痛閾與嗎啡組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞ 0.05);0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF在給藥后痛閾提高百分率分別為11.23%、74.44%和117.44%，6 h時0.3 mg/kg的CVAF組小鼠痛閾與嗎啡組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和 0.3 mg/kg CVAF 在給藥后痛閾提高百分率分別為62.81%、95.58%和155.86%;0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和 0.3 mg/kg的CVAF在給藥后8 h小鼠痛閾提高百分率分別為42.08%、67.86%和136.17%。CVAF的鎮(zhèn)痛作用自0.5 h開始，且持續(xù)8 h仍存在。上述結(jié)果顯示CVAF能使小鼠對熱刺激的反應(yīng)時間延長，且具劑量相關(guān)性，見圖4。

4.2 醋酸扭體法 在醋酸扭體實驗中，腹腔注射0.03 mg/kg、0.1 mg/kg 和0.3 mg/kg CVAF 后，隨著劑量增加，0.1 mg/kg和0.3 mg/kg小鼠扭體次數(shù)與對照組相比，差異顯著(P＜0.01);0.3 mg/kg小鼠扭體次數(shù)與嗎啡組相比無明顯差異(P＞0.05)。小鼠扭體抑制率分別為27%、50%和70%，說明CVAF能降低小鼠對化學(xué)刺激引起的敏感性，見表1。

討 論

Figure 4.Analgesic effect of CVAF examined by hot-plate test.Mean ±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NS group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs morphine group.圖4 熱板法測定CVAF對小鼠痛閾的影響

表1 CVAF組分對小鼠醋酸扭體次數(shù)的影響Table 1.The effect of CVAF on mice in acetic acid writhing test(mean±SD.n=10)

皖南地區(qū)蛇毒資源豐富，蛇毒中有效成分的開發(fā)和應(yīng)用具有廣闊的應(yīng)用前景。蛇毒是一種天然生物毒庫，具有抗凝［3］、鎮(zhèn)痛［4］、抗腫瘤等［5］廣泛的生物學(xué)及藥理學(xué)活性。疼痛是多種疾病引起的常見臨床癥狀，已成為繼呼吸、脈搏、體溫和血壓之后的“第五大生命指征”。臨床常用的鎮(zhèn)痛藥主要為非甾體類抗炎藥和阿片類強效鎮(zhèn)痛藥。前者以阿司匹林為代表，是弱鎮(zhèn)痛藥;后者以嗎啡為代表，是強鎮(zhèn)痛藥。非甾體類抗炎藥具有抗炎、退熱和鎮(zhèn)痛作用，臨床用途較廣，作為鎮(zhèn)痛藥主要用于慢性疼痛。其特點是鎮(zhèn)痛作用溫和，無成癮性。缺點是鎮(zhèn)痛強度不夠，消化道不良反應(yīng)較嚴重，個別藥物有心血管不良反應(yīng)、肝毒性或過敏反應(yīng)。阿片類鎮(zhèn)痛藥是麻醉性鎮(zhèn)痛藥，臨床限于急性銳痛的短期止痛，如外科手術(shù)和術(shù)后止痛、骨折及急性內(nèi)臟絞痛，也用于一些終末期患者無法治療的頑固性疼痛，如晚期癌癥的劇烈疼痛。其特點是起效快，鎮(zhèn)痛作用強。缺點是具有成癮性，耐受性，引起呼吸抑制、內(nèi)分泌機能減退等嚴重不良反應(yīng)［6］。目前缺乏作用強但不成癮，可長期安全服用的鎮(zhèn)痛藥。1936年Macht等曾報道與強鎮(zhèn)痛類藥物如嗎啡相比，眼鏡蛇毒治療因癌組織壓迫神經(jīng)引起疼痛的晚期癌癥病人有顯著療效。與強鎮(zhèn)痛類藥物如嗎啡相比，眼鏡蛇毒制劑無麻醉作用，作用持久，連續(xù)應(yīng)用無耐受，不成癮;相反地在出現(xiàn)療效后用量可遞減。但是鎮(zhèn)痛作用起效較慢以及其它副作用限制其臨床的應(yīng)用。因此，成分復(fù)雜的粗毒中分離純化出純度較高而效果良好的鎮(zhèn)痛組分，并對其結(jié)構(gòu)性質(zhì)、作用機制進行研究具有重要意義。本實驗采用離子交換色譜和排阻層析結(jié)合的方法對皖南地區(qū)眼鏡蛇粗毒進行分離純化篩選得到一種鎮(zhèn)痛因子CVAF，相對分子量為6.5 kD，從 SDS-PAGE電泳來看可呈單一主帶，可認為達到電泳純。

通過急性生理性疼痛模型小鼠熱板法及化學(xué)致痛模型醋酸扭體實驗發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物具有劑量依賴性的中樞和外周鎮(zhèn)痛作用，熱板法為熱刺激疼痛模型，舔足底動作不僅是脊髓反應(yīng)，而且與高級中樞有關(guān)。小鼠熱板法是通過足部溫度感受器感受熱刺激，信息經(jīng)軀體神經(jīng)的傳入，在有高位中樞參與下完成的軀體縮爪反應(yīng)。熱板法實驗顯示CVAF的鎮(zhèn)痛作用自0.5 h開始，且持續(xù)8 h仍存在。扭體法中0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF 在給藥后小鼠扭體抑制率分別為27%、50%和70%。呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，高劑量組鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于嗎啡組。提示CVAF對化學(xué)物質(zhì)刺激致痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。熱板法和扭體法致痛的原因、性質(zhì)、傳導(dǎo)途徑、強度各有差別，提示CVAF的鎮(zhèn)痛作用機制十分復(fù)雜，可能涉及多種通路。疼痛的產(chǎn)生及調(diào)控是涉及多部位多機制的復(fù)雜過程，目前研究發(fā)現(xiàn)蛇毒鎮(zhèn)痛可能與膽堿能系統(tǒng)［7-8］、NO/cGMP/PKG 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［9-10］、巨噬細胞活性抑制［11］、內(nèi)源性阿片系統(tǒng)等［12］有關(guān)，接下來我們將建立炎性痛和病理性神經(jīng)痛模型，測定行為學(xué)和血清學(xué)指標，從而對其確切的鎮(zhèn)痛機制做進一步的探討，為臨床鎮(zhèn)痛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

此外在本研究中，為了排除蛇毒自身毒副作用對動物的影響［13］，我們使用功能觀測組合檢查方法觀察實驗動物的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)治療量的眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛因子對動物的自發(fā)活動、進食無明顯影響，未發(fā)現(xiàn)異常的體位、活動水平和步態(tài);未發(fā)現(xiàn)異常行為如強迫性噬咬、自殘、轉(zhuǎn)圈和后退等;未出現(xiàn)痙攣、震顫、流淚、紅色淚液、流延、腹瀉和嘶咬等表現(xiàn)，說明CVAF的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能與其毒性無關(guān)。

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