嚴(yán)方方，譚曉風(fēng)* ，龍洪旭

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004;2.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

油桐(Vernicia fordii(Hemsl.)Airy-Shaw)是大戟科(Euphorbiaceae)油桐屬(Vernicia Lour.)，落葉喬木，原產(chǎn)我國(guó)，在南方15省(區(qū))均有分布，被列為我國(guó)四大木本油料樹種之一［1－2］。油桐種子榨出的桐油是優(yōu)質(zhì)干性油，化學(xué)性質(zhì)極為活潑，是重要的工業(yè)油料，傳統(tǒng)上廣泛應(yīng)用于涂料等化學(xué)工業(yè)［3］，還可作為燃料［4－5］，是一種優(yōu)勢(shì)明顯的生物柴油原料［6－7］。近年研究還發(fā)現(xiàn)，桐油具有抗腫瘤作用［8］。桐油籽含油率高(50% ～70%)，且脂肪酸含有較長(zhǎng)的碳直鏈［9］，抗性強(qiáng)，能在貧瘠土地上生長(zhǎng)，不與糧食爭(zhēng)地，這些優(yōu)勢(shì)都使其成為合成生物柴油的優(yōu)勢(shì)原料［10－13］。

油桐中的油脂是通過脂肪酸合成途徑獲得，植物脂肪酸合成途徑屬于已知兩類脂肪酸合成途徑中的第2類(FASⅡ)［14］。這一途徑中β－酮脂酰－ACP合酶Ⅲ(beta-ketoacyl-ACP synthaseⅢ，KASⅢ)扮演著催化?；鵄CP與丙二酸單酰ACP進(jìn)行脂肪酸合成起始縮合反應(yīng)(Claisen condensation)的角色［15］。目前，一些植物如蓖麻(Ricinus communis)、麻瘋樹(Jatropha curcas)和向日葵(Helianthus annuus)的KASⅢ基因已克隆完成［16－18］。植物KASⅢ除了主要以乙酰ACP為底物外，還能以另外一些?；鵄CP為底物合成具有不同碳鏈結(jié)構(gòu)的脂肪酸終產(chǎn)物，這一研究結(jié)果跟細(xì)菌KASⅢ的研究結(jié)果類似，表明在植物中KASⅢ也是脂肪酸碳鏈結(jié)構(gòu)的主要決定因子之一［19－20］。有研究發(fā)現(xiàn)植物中脂肪酸合成的速率受到KASⅢ活性的影響，這一結(jié)果表明KASⅢ可能是脂肪酸合成途徑的限速酶之一［21］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 采用的油桐近成熟種子來自湖南省長(zhǎng)沙市天際嶺林場(chǎng)。2011年8月底，采集對(duì)年桐果實(shí)，－80℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 試劑 PureLinkTM RNA Mini Kit，5'RACE System For Rapid Amplification of cDNA Ends，3'RACE System For Rapid Amplification of cDNA Ends試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，2 ×Taq PCR MasterMix購(gòu)自 Fermentas公司;pMD18-T Vector，PrimeSTAR HS DNA Polymerase購(gòu)自Takara;Gel Extraction Kit購(gòu)自安比奧公司;pEASY-Blunt Simple Cloning Kit購(gòu)自全式金公司;引物合成及測(cè)序分別由華大基因和博尚公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 用Invitrogen公司的PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒提取油桐近成熟種子總RNA。利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。

1.2.2 KASⅢ基因的克隆 根據(jù)已克隆的蓖麻(GenBank:XM_002529743)、大豆(GenBank:NM_001250806)、花生(GenBank:EU823328.1)、陸地棉(GenBank:HM236495.1)、麻瘋樹(GenBank:DQ987701.1)、擬南芥 (GenBank:L31891.1)、向日葵 (GenBank:EF514400.1)、油棕 (GenBank:DQ459441.1)、棕櫚(GenBank:DQ459442.1)、紫蘇(GenBank:AF026150.1)氨基酸保守區(qū)對(duì)應(yīng)的堿基保守區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引簡(jiǎn)并引物(表1)。以油桐近成熟種子總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到第一條鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段序列。在片段序列基礎(chǔ)上利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3'RACE和5'RACE引物通過巢式擴(kuò)增得到全長(zhǎng)序列(表1)。

1.2.3 PCR程序 以油桐種子的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL，簡(jiǎn)并PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，3個(gè)循環(huán);94 ℃ 40 s，60 ℃ /58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，各15個(gè)循環(huán);94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，3個(gè)循環(huán)，72℃ 8 min;4℃保存。5'末端擴(kuò)增:94℃5 min，94℃ 40 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min;4℃保存。3'末端擴(kuò)增:94℃5 min，94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 8 min;4℃保存。全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增:94℃5 min，94 ℃ 40 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，2 個(gè)循環(huán)，94 ℃ 40 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，4 個(gè)循環(huán);94 ℃ 40 s，64 ℃ /62 ℃ /60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，各7個(gè)循環(huán);94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，4個(gè)循環(huán)，94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，4個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min;4℃保存。

1.2.4 序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用gendoc將序列翻譯成氨基酸，在線分析蛋白質(zhì)和DNA同源性(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。然后利用 Vector NTI 10.3.0 進(jìn)行 KASⅢ基因序列比對(duì)，用MEGA4.0進(jìn)行多序列比對(duì)并計(jì)算構(gòu)建聚類分析圖。運(yùn)用在線分析軟件(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)分析、預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采用在線分析軟件 http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl中Hphob./Kyte＆Doolittle模式對(duì)蛋白的疏水性進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，并運(yùn)用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(http://www.predictprotein.org/)以及跨膜區(qū)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html)對(duì)油桐KASⅢ蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表1 PCR引物及擴(kuò)增程序Tab.1 Primers used in this study and the processes of PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆與核苷酸序列分析

簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得526 bp的簡(jiǎn)并片段(圖1－Ⅰ)。5'RACE和3'RACE分別得到870，630 bp的片段(圖1－Ⅱ、圖1－Ⅲ)，將3個(gè)片段拼接，得到1條完整的cDNA序列，長(zhǎng)度為1 901 bp。在5'端和3'端分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增cDNA完整編碼區(qū)。測(cè)序結(jié)果表明，該片段長(zhǎng)度為1 651 bp(圖1－Ⅳ)，其序列與拼接序列編碼區(qū)的一致性為100%。cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列見圖2，該cDNA含有1個(gè)1 209 bp的編碼框，編碼403個(gè)氨基酸。5'非編碼區(qū)長(zhǎng)445 bp，3'非編碼區(qū)的長(zhǎng)度為202 bp，在1 841 bp處發(fā)現(xiàn)了加尾信號(hào)AATAA，信號(hào)后19 bp處出現(xiàn)帶有17個(gè)多聚A的尾巴，這表明擴(kuò)增得到了KASⅢ基因的全長(zhǎng)序列，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，其結(jié)果也證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

圖1 油桐KASⅢPCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR Products of KASⅢ gene from Vernicia fordii

2.2 蛋白質(zhì)序列分析

圖2 KASⅢ基因cDNA全長(zhǎng)序列分析Fig.2 The cDNA completed sequence analysis of KASⅢ

圖3 油桐KASⅢ與其他植物KASⅢ 基因編碼的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Alignment of deduced amino acids of KASⅢ and other KASⅢ-like genes

將克隆得到的KASⅢcDNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與其他物種的KASⅢ基因所編碼的氨基酸通過軟件Vector NTI 10.3.0和GENDOC進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)油桐KASⅢ與其他植物的KASⅢ基因所編碼的氨基酸同源性大多在75%以上，其中與麻瘋樹和蓖麻相似度達(dá)90%和87%(圖3)。從圖4中可以看出，KASⅢ基因在進(jìn)化上較為保守，與其他植物KASⅢ的相似性較高，不同植物中的KASⅢ蛋白質(zhì)序列N端保守性低，C端區(qū)域保守性較高。

圖4 油桐KASⅢ蛋白和其他植物KASⅢ蛋白的聚類分析Fig.4 Phylogenetic tree of the predicted KASⅢ homologous proteins from different species

圖5 蛋白質(zhì)疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity profile seed

圖6 Tmpred對(duì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 Result of Tmpred prediction

用軟件MEGA4.0對(duì)20種植物KASⅢ氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，油桐KASⅢ基因編碼蛋白與麻瘋樹、蓖麻、葡萄的KASⅢ基因在親緣進(jìn)化關(guān)系上最近(圖4)。KASⅢ蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，該蛋白分子式為C1858H2979N531O585S17，蛋白分子量為42 661.3 kv;它由20種氨基酸組成，等電點(diǎn)為5.78。疏水性分析結(jié)果如圖5所示，由圖可知KASⅢ整個(gè)蛋白的疏水指數(shù)從－2.644到2.389。大約在183位氨基酸表現(xiàn)出疏水性，整個(gè)蛋白質(zhì)基本上是表現(xiàn)出親水性的。一般蛋白質(zhì)的疏水性與跨膜區(qū)是相互統(tǒng)一的，圖6直觀地給出了KASⅢ蛋白的跨膜區(qū)域(圖中的實(shí)線代表跨膜方向由內(nèi)向外，虛線表示跨膜方向由外向內(nèi))，分析表明該蛋白有3個(gè)比較明顯的跨膜區(qū)(評(píng)分超過500):一個(gè)是169～187位氨基酸的跨膜區(qū)，跨膜方向由外向內(nèi)，一個(gè)是216～233位氨基酸的跨膜區(qū)，跨膜方向由內(nèi)向外，另一個(gè)是380～400位氨基酸的跨膜區(qū)，跨膜方向由外向內(nèi)。Predictprotein網(wǎng)站在線分析軟件預(yù)測(cè)油桐KASⅢ蛋白中α螺旋結(jié)構(gòu)為31.0%，β折疊為18.1%，無規(guī)則卷曲及其他結(jié)構(gòu)達(dá)到了50.9%。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的β-酮脂酰-ACP合酶基因KASⅢ的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增出簡(jiǎn)并片段，通過5'RACE和3'RACE技術(shù)獲得了油桐KASⅢ全長(zhǎng)cDNA，含1 901 bp，開放閱讀框?yàn)? 209 bp，編碼403個(gè)氨基酸，5'UTR和3'UTR分別為445 bp和202 bp，表明該cDNA是一個(gè)完整度較好的全長(zhǎng)cDNA。

油桐KASⅢ基因是脂肪酸合成的關(guān)鍵基因，因此克隆KASⅢ基因以及今后對(duì)其表達(dá)調(diào)控機(jī)理與功能的研究，將為木本植物脂肪酸合成網(wǎng)絡(luò)的解析提供切入點(diǎn)并有助于更深入的闡述植物脂肪酸合成的分子機(jī)理，從而最終將研究結(jié)果應(yīng)用到對(duì)油桐的遺傳改良中去。另外，KASⅢ對(duì)植物油脂的組成成分和特性具有重要影響，因此對(duì)油桐KASⅢ基因的研究是油桐分子育種的基礎(chǔ)，通過調(diào)控KASⅢ基因的表達(dá)可以提高種子的含油率，改善桐油的品質(zhì)，從而加快油桐遺傳改良的進(jìn)程。

目前對(duì)油桐的研究主要是高產(chǎn)栽培和良種選育，相關(guān)的分子生物學(xué)研究還不夠深入。利用基因工程手段定向改造油桐，增加桐油的產(chǎn)量，改善桐油的品質(zhì)，將會(huì)極大提高油桐的綜合利用能力，然而鑒定和分離脂肪酸合成代謝通路基因是進(jìn)行基因工程操作的先決條件。

本文對(duì)油桐KASⅢ基因的cDNA序列進(jìn)行了較系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，包括序列特征分析、多序列比對(duì)、相似性與同源性分析、蛋白質(zhì)理化特性以及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等，為油桐后續(xù)分子生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步揭示油桐油脂合成規(guī)律及良種選育提供參考。

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