周澤科，張超群，蔣軍喜*，胡長志，黃 婷

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045;2.江西煙葉科學(xué)研究所，江西 南昌 330025)

青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的典型細(xì)菌性維管束病害，可侵染包括煙草在內(nèi)的44個(gè)科一百多種植物［1］。該病原菌感染植株后可在維管束內(nèi)大量繁殖，堵塞導(dǎo)管并分泌有毒物質(zhì)，導(dǎo)致植株迅速萎蔫甚至死亡［2］。青枯病對(duì)我國長江流域及以南各煙區(qū)的煙葉生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。近年來，隨著異常氣候的頻繁出現(xiàn)、煙草種植面積的持續(xù)擴(kuò)大以及連作年限的增加，煙草青枯病在江西煙區(qū)的發(fā)病也呈逐年加重趨勢，其中以石城縣等老煙區(qū)病情尤為嚴(yán)重。

根據(jù)賈春燕［3］、陳澤鵬等［4］的報(bào)道，使用不同配比的化學(xué)農(nóng)藥已能對(duì)煙草青枯病起到一定的防治作用，但迄今選育抗病品種仍是防治此病最為有效的方法。為明確江西煙草青枯菌的致病性變異，為今后煙草抗性資源篩選和抗病品種選育工作的開展提供理論依據(jù)，筆者于2012年4—6月從江西省石城、瑞金、會(huì)昌、信豐、廣昌、峽江等縣(市)煙田感病煙株上分離獲得24個(gè)致病性煙草青枯病菌菌株，選取其中6個(gè)代表性菌株，對(duì)其生理小種和生化型進(jìn)行了鑒定，現(xiàn)將鑒定結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離與篩選

從江西各主要種煙縣(市)采集呈典型煙草青枯病癥狀的煙株(品種K326)，切取病莖小塊維管束組織，采用培養(yǎng)皿稀釋分離法于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA)上分離青枯病菌，經(jīng)16S rDNA核苷酸序列測定［5］后于2，3，5—氯化三苯基四氮唑培養(yǎng)基(即TTC)上純化，篩選得到24株煙草青枯病菌菌株，菌株于4℃無菌水中保存，各菌株編號(hào)及來源地見表1。

表1 供試菌株來源Tab.1 Original source of the tested strains

1.2 生理小種鑒定

1.2.1 鑒別寄主的育苗和接種 選用煙草(K326)、茄子(正興墨茄)、番茄(合作906大果型)、花生(大粒子)和馬鈴薯(市售品種)作為煙草青枯病菌的鑒別寄主。將于無菌水中催芽24 h后的煙草、茄子和番茄的種子以及花生種子、馬鈴薯塊莖分別播種于營養(yǎng)土(植物培養(yǎng)基、滅菌細(xì)土按1∶2體積比拌勻)中，25℃溫室育苗至3～4葉后，將幼苗移栽于直徑為12 cm的營養(yǎng)缽中，每缽1株，繼續(xù)溫室培育至5～7葉后待用。

選取6株具有代表性的煙草青枯病菌株Sc－1、Rj－1、Hc－1、Xf－1、Gc－1和 Xj－1作為供試菌株，分別于NA液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后無菌水稀釋成濃度為3×108cfu/mL的菌液，采用菌液浸根接種法［6］分別對(duì)鑒別寄主進(jìn)行接種，每處理接種數(shù)量均為8株，實(shí)驗(yàn)設(shè)置接種清水作對(duì)照。接種完成后，將植株置于30℃溫室中培養(yǎng)，定期澆水以保證濕度，逐日觀察并記錄發(fā)病情況，9 d后參照煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(YC/T39—1996)統(tǒng)計(jì)發(fā)病結(jié)果，計(jì)算出病情指數(shù)。

煙草青枯病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí)，全株無病;1級(jí)，莖部偶有褪綠斑，或在有條斑一側(cè)有少數(shù)葉片凋萎;2級(jí)，莖部有黑色條斑，但尚未達(dá)到頂部，或病側(cè)半數(shù)以上葉片凋萎;3級(jí)，莖部黑色條斑到達(dá)植株頂部，或病側(cè)三分之二以上葉片調(diào)萎;4級(jí)，病株基本枯死。

1.2.2 煙葉浸潤試驗(yàn) 將6個(gè)供試菌株各配成濃度為1×1010cfu/mL的菌液，分別進(jìn)行煙葉浸潤試驗(yàn)。選取5～7葉期K326煙株中下部葉片，用滅菌注射器將適量菌液從葉片背面注入，每葉注射20個(gè)點(diǎn)，每菌株注射3片葉片，以注射清水作對(duì)照，注射點(diǎn)用濕潤脫脂棉進(jìn)行保濕，注射煙株置于30℃溫室中生長，分別于接種后24，36，48，60 h統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 產(chǎn)黑色素試驗(yàn) 將選取的6個(gè)供試菌株分別接于L－酪氨酸平板培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株接種3皿，另設(shè)3皿不接菌作為空白對(duì)照。平皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從接菌后2 d到6 d逐日觀察記錄各菌株的產(chǎn)黑色素情況。

1.3 生化型的測定

1.3.1 菌株對(duì)3種雙糖和3種己醇的利用情況 將6個(gè)供試菌株分別接于乳糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇和甜醇6種不同的試管斜面培養(yǎng)基上，每處理3次重復(fù)(接種3支試管)，設(shè)空白培養(yǎng)基作對(duì)照。接種試管置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種后5，7，9 d觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。參照Hayward［7］、何禮遠(yuǎn)［8］和林抗美等［1］的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)供試菌株進(jìn)行生化型劃分。

1.3.2 菌株對(duì)硝酸鹽的產(chǎn)氣與還原反應(yīng) 采用針刺接種法將供試菌株接種于含0.1%KNO3牛肉膏蛋白胨試管平面培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株接種5管，其中2管用瓊脂膠密封管口，3支不封，另設(shè)5支不接菌空白培養(yǎng)基作對(duì)照，處理完畢將各試管置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)。封管試管于接菌2 d后，逐日觀察記錄產(chǎn)氣情況;未封管試管分別于接菌后3，5，7 d向試管內(nèi)加入格里斯氏A液和B液，記錄各時(shí)間段各試管內(nèi)的顏色變化反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對(duì)各鑒別寄主的致病性

接種后9 d，對(duì)各鑒別寄主的病情進(jìn)行分級(jí)調(diào)查，計(jì)算獲得的病情指數(shù)見表2。由表2可知，供試的6個(gè)菌株對(duì)全部鑒別寄主均有強(qiáng)致病性，發(fā)病率均為100%，而清水對(duì)照均無發(fā)病癥狀。根據(jù)Buddenhagen［9］、何禮遠(yuǎn)等［10］確定的青枯菌生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出6個(gè)供試菌株均為生理小種1號(hào)。

供試菌株在5種鑒別寄主上的平均病情指數(shù)從高到低依次為98.5(Xf－1)、98.0(Rj－1)、95.5(Gc－1)、95.4(Hc－1)、90.6Xj－1)和89.9(Sc－1)。Xf－1 在各供試菌株中致病性最強(qiáng)，不同菌株對(duì)不同鑒別寄主的致病程度存在一定差異，平均病情指數(shù)的差異為0.7～8.6。5種鑒別寄主對(duì)供試菌株均表現(xiàn)出高度敏感反應(yīng)，平均病情指數(shù)從高到低分別為99.1(煙草)、98.8(番茄)、97.5(花生)、90.1(茄子)和87.9(馬鈴薯)，馬鈴薯對(duì)供試菌株的抵抗力在5種鑒別寄主中相對(duì)最強(qiáng)。

表2 煙草青枯菌接種鑒別寄主的病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Disease index statistics of Ralstonia solanacearum on differential hosts

2.2 煙葉浸潤和產(chǎn)黑色素試驗(yàn)

6個(gè)供試菌株浸潤煙草葉片24 h后，浸潤點(diǎn)無明顯顏色變化;36 h后，浸潤點(diǎn)開始出現(xiàn)淺黃色斑點(diǎn);48 h后浸潤斑點(diǎn)由淺黃色漸變?yōu)闇\褐色;60 h后，浸潤點(diǎn)均呈現(xiàn)褐色;清水浸潤葉片則無明顯癥狀。圖1為菌株的煙葉浸潤試驗(yàn)結(jié)果。

L—酪氨酸培養(yǎng)基接種各供試菌株3 d后開始產(chǎn)生少量黑色素，隨著接種時(shí)間的增加，黑色素的量逐漸增多，接種6 d后，培養(yǎng)基均呈現(xiàn)為深褐色。根據(jù)浸潤和產(chǎn)黑色素試驗(yàn)結(jié)果，6個(gè)供試菌株也被鑒定為生理小種1號(hào)。

圖1 煙葉浸潤試驗(yàn)Fig.1 Infiltration test of R.solanacearum into tobacco

2.3 供試菌株的生化型測定

供試菌株生化型測定結(jié)果見表3。6個(gè)供試菌株均能利用乳糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇和山梨醇而使培養(yǎng)基從藍(lán)色變成黃色，但各菌株均不能利用甜醇。供試菌株接種含0.1%KNO3的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基時(shí)，均能發(fā)生脫氮作用產(chǎn)生氣體;加入格里斯氏A液和B液后，培養(yǎng)基顏色呈紫紅色，表明硝酸鹽發(fā)生還原反應(yīng)，有亞硝酸根生成。各空白對(duì)照組份均無顏色變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試的6個(gè)江西煙草青枯菌株為生化型Ⅲ－1(即生化型Ⅲ中的1號(hào)亞型)。

表3 供試菌株的生化型測定結(jié)果Tab.3 Biovar determination of tested strains

3 結(jié)論與討論

本文從采自石城、瑞金、會(huì)昌、信豐、廣昌和峽江等江西省主要產(chǎn)煙縣(市)的感病煙株上共分離得到24株致病性青枯勞爾氏菌，選取其中具有代表性的6個(gè)菌株作為供試菌株，進(jìn)行生理小種和生化型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn):所有6個(gè)供試菌株均屬于生理小種1號(hào)，而在生化型劃分中均屬于生化型Ⅲ－1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者初步認(rèn)為江西煙草青枯病菌致病性差異不明顯，這對(duì)江西開展煙草青枯病抗性育種和抗病品種利用是一個(gè)有利的條件。

青枯勞爾氏菌的寄主范圍非常廣泛，涉及50多個(gè)科的200種植物，其中包括馬鈴薯、番茄、茄子、辣椒、甘薯、花生、煙草、香蕉、桑樹、桉樹、油橄欖等許多重要的糧食、蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物［11］。青枯菌共分為5 個(gè)生理小種(Race 1，2，3，4，5)，同時(shí)也被分為5 個(gè)生化型或生化變種(BiovarⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ)，但生理小種與生化型之間并無必然的聯(lián)系［12］。除本結(jié)果外，我國山東、湖南、廣西、重慶、四川等地也相繼開展了煙草青枯病菌的生理小種和生化型鑒定研究，已報(bào)道的全部生理小種鑒定結(jié)果均為生理小種1［13－17］，而生化型鑒定結(jié)果則不完全相同，其中，大部分菌株屬于生化型Ⅲ和生化型Ⅳ，少數(shù)菌株則屬于生化型Ⅱ和生化型Ⅴ［18］。由此表明，目前我國煙草青枯病菌在總體上致病性分化均不明顯，但生化型存在一定的豐富性，至于生化型如何反映我國煙草青枯病菌的內(nèi)在本質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

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