王 前，陳?？?，王俊麗

(1.中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京100081;2.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川750021;3.北京市八達(dá)嶺林場(chǎng)，北京102112)

經(jīng)典分類學(xué)主要通過研究化石證據(jù)、形態(tài)解剖學(xué)和生理學(xué)等方面來建立生物進(jìn)化的總體模式以及勾畫物種之間的譜系關(guān)系。自20 世紀(jì)中后期，計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物技術(shù)取得了迅猛發(fā)展，分子遺傳學(xué)資料迅速積累，使得分子進(jìn)化逐漸被應(yīng)用于生物進(jìn)化研究［1－2］。分子進(jìn)化是從分子水平上研究進(jìn)化，通過對(duì)核酸和蛋白質(zhì)大分子序列分析，能夠解析出其中蘊(yùn)含的進(jìn)化信息，推斷其進(jìn)化歷史，為生物進(jìn)化提供重要的依據(jù)［3］。

生物固氮是氮元素進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)與能量循環(huán)的重要途徑，根據(jù)固氮微生物與其它生物的關(guān)系，可將生物固氮分為自生固氮、聯(lián)合固氮和共生固氮3 種不同的體系［4－5］，其中根瘤菌與豆科植物的共生固氮是自然界中主要的固氮體系［6］，在固氮微生物的固氮基因中，以根瘤菌為例，參與根瘤發(fā)育的固氮基因分為3 類:第1 類是結(jié)瘤基因，如nol 基因、nod 基因和noe 基因;第2 類是與根瘤菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因，如脂多糖基因(lps 基因)、胞外多糖基因(exo 基因)、和ndv 基因;第3 類是固氮酶基因(簡(jiǎn)稱nif 基因)和共生固氮基因(fix 基因)［7－9］。本文研究了根瘤菌和豆科植物共生作用模式菌苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti 1021)中的3 類固氮基因的進(jìn)化關(guān)系。

nifH 基因負(fù)責(zé)編碼固氮酶組分鐵蛋白亞基，為固氮微生物所共有，具有高度保守性，是科學(xué)家研究生物固氮的重點(diǎn)領(lǐng)域之一［10］。在過去幾年中，越來越多固氮基因(nif 基因)已被確定，Renato Fani 等通過研究nifD，nifK，nifE，nifN，nifH 基因的進(jìn)化歷史，了解固氮基因的分子進(jìn)化［11］。張于光等［12］利用PCR－RFLP 和測(cè)序分析對(duì)青海三江源高寒草甸土壤微生物固氮基因(nifH)的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究。馬驛等［13］通過PCR 擴(kuò)增、基因克隆等方法對(duì)恩諾沙星影響下的土壤微生物固氮酶nifH 基因進(jìn)行了分子多樣性分析。

在根瘤菌與豆科植物形成的共生固氮體系中，根瘤菌與豆科植物通過協(xié)同作用固氮。豆科植物的固氮基因enod40 為早期結(jié)瘤素基因(簡(jiǎn)稱enod)的一種，參與根瘤形成與發(fā)育，它與其他固氮基因一起參與協(xié)同固氮［14－15］。據(jù)報(bào)道，enod40 基因在根瘤菌器官形成過程中起著重要的作用，在多種植物中該基因編碼的核酸序列有較高的保守性［16－18］。

目前，國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于固氮基因分離、鑒定、定位、克隆、表達(dá)調(diào)控機(jī)理等方面的研究［19－21］，但在固氮基因進(jìn)化方面的研究較少［22］。本文從同一固氮微生物固氮基因、同一固氮基因在不同固氮微生物和不同固氮植物3 個(gè)方面進(jìn)行固氮基因的分子進(jìn)化分析，在分子水平上研究了生物間的親緣關(guān)系，并繪制出生物進(jìn)化分子樹，為進(jìn)一步深入研究固氮基因的進(jìn)化機(jī)制提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

表1 S.meliloti 1021 需要作分子進(jìn)化分析的基因片段Tab.1 S.meliloti 1021 gene fragments used in the molecular evolution analysis

表2 不同固氮微生物nifH 基因序列Tab.2 The different nifH gene fragments of nitrogen－fixing microorganisms

表3 不同固氮植物enod40 基因序列Tab.3 The different enod40 gene fragments of nitrogen-fixing plants

1.1.1 Sinorhizobium meliloti 1021 固氮基因序列的獲得與整理 登錄美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站主頁，在GenBank 中搜尋Sinorhizobium meliloti 1021 固氮基因序列，最終用作分子進(jìn)化分析的固氮基因序列(表1)。

1.1.2 固氮微生物nifH 基因的獲得與整理 登錄美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站主頁，在GenBank 中搜尋豌豆根瘤菌、費(fèi)氏中華根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、田菁固氮根瘤菌等固氮微生物nifH 基因序列，最終用作分子進(jìn)化分析的固氮基因序列(表2)。

1.1.3 固氮植物enod40 基因的獲得與整理 登錄美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站主頁，在GenBank 中搜尋百脈根、大豆、大巢菜、豌豆等固氮植物enod40 基因序列，最終用作分子進(jìn)化分析的固氮基因序列(表3)。

1.2 方法

先用BioEdit7.0 從核酸序列中找到需要作分子進(jìn)化分析的固氮基因部分并分別保存到3 個(gè)文件中;利用Clustal X1.83 對(duì)序列進(jìn)行完全比對(duì);再用BioEdit7.0 將輸出的比對(duì)文件(aln 格式)轉(zhuǎn)換成fas 格式文件;最后導(dǎo)入MEGA4.0 軟件，通過鄰接法(Neighbor －Joining，簡(jiǎn)稱NJ)，經(jīng)過自展法(Bootsrap)1 000 次重復(fù)驗(yàn)證，以保證樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性，構(gòu)建基因分子進(jìn)化樹。

圖1 Sinorhizobium meliloti 1021 固氮基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of nitrogen－fixing gene in Sinorhizobium meliloti 1021

圖2 固氮微生物nifH 基因進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of nifH gene in nitrogen－fixing microorganisms

2 結(jié)果與分析

2.1 Sinorhizobium meliloti 1021 固氮基因進(jìn)化樹分析

從Sinorhizobium meliloti 1021 固氮基因進(jìn)化樹(圖1)可知，除了lpsL 和exoA 基因間的自展值(bootstrap 值)小于70%外，其它基因間均大于70%，因此該進(jìn)化樹可認(rèn)為是可靠的。不同結(jié)瘤基因間的差異極小，自展值達(dá)100%。固氮基因可分為固氮酶基因(nif 基因)和共生固氮基因(fix 基因)，由于功能的不同而分為兩枝，nifH 與nod 基因間的自展值為74%。exoA 和lpsL 均為根瘤菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因，由于exoA 為糖基轉(zhuǎn)移酶基因，lpsL 為脂多糖基因，功能的不同造成兩者差異較大，自展值為53%。該進(jìn)化樹分枝與根瘤菌中參與共生固氮的基因分類分為結(jié)瘤基因(nod、nol、noe 基因等)、與根瘤菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因(如exo、lps、ndv 基因等)和固氮酶基因3 類相符合，因?yàn)榻Y(jié)瘤與固氮在生物固氮過程中密切相關(guān)，在實(shí)際的根瘤菌固氮基因的進(jìn)化中，能否認(rèn)為nod、nif 和fix 基因?yàn)橐粋€(gè)分枝，lps 和exo基因?yàn)橐粋€(gè)分枝，還有待于進(jìn)一步研究。

圖3 固氮植物enod40 基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of enod40 gene in nitrogen－fixing plants

2.2 固氮微生物nifH 基因進(jìn)化樹分析

從固氮微生物固氮基因(nifH)進(jìn)化樹(圖2)可以看到，自展值為73% ～100%，大于70%，因此該進(jìn)化樹是可靠的。該進(jìn)化樹分為4 枝，根瘤菌為一枝，nifH 進(jìn)化樹中不同根瘤菌的分枝與目前根瘤菌16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹的分類相比較還有一定差別［23］，伯克霍爾德氏菌和根瘤菌聚合成為一枝，研究表明伯克霍爾德氏菌具有固氮的能力［24］，但其固氮方式未見報(bào)道，分析發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德氏菌與根瘤菌的nifH 基因序列相似度較大，其固氮方式是否為共生固氮還有待進(jìn)一步研究;肺炎克氏桿菌為一枝，它是兼性厭氧自身固氮微生物;弗蘭克氏菌為一枝，其nifH 基因進(jìn)化較為一致，自展值為100%;滿江紅魚腥藻為一枝，這可能是它在固氮方式上與根瘤菌和弗蘭克氏菌有很大差異。

2.3 固氮植物enod40 基因進(jìn)化樹分析

從固氮植物固氮基因(enod40)進(jìn)化樹(圖3，以單子葉植物的禾本科為外類群)看出，自展值基本上大于70%，認(rèn)為該進(jìn)化樹是可靠的。該進(jìn)化樹分為4 枝，大豆、菜豆、長(zhǎng)喙田菁百脈根等10 種植物聚為一枝，自展值為89%;番茄和煙草聚為一枝，自展值為100%;黑麥草、水稻和短藥野生稻聚為一枝，自展值為100%;粗枝麻黃獨(dú)自為一枝。從另一方面看，這4 分枝剛好為4 個(gè)科，與APGIII 的分類基本吻合［25］。通過分析得出，enod40 基因進(jìn)化樹將植物分為雙子葉植物和單子葉植物兩大類，雙子葉植物主要通過與固氮微生物共生固氮，而禾本科植物通過聯(lián)合固氮利用大氣中的氮元素［26］，它們都共同有植物早期結(jié)瘤素基(enod40)，表明enod40 基因?yàn)檩^為原始的基因，在固氮過程中起著重要作用。

3 討論

本研究首次以根瘤菌和豆科植物共生作用模式菌苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti 1021)里的不同固氮基因序列以及從GenBank 數(shù)據(jù)庫中檢索出的其他固氮微生物的nifH 基因和不同植物中的enod40 基因序列為研究對(duì)象，通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從分子水平上確定了固氮基因、固氮微生物、固氮植物之間親緣關(guān)系和生物進(jìn)化順序，為固氮生物進(jìn)化論的研究提供了更為客觀、精確、定量的研究結(jié)論，促進(jìn)了固氮基因進(jìn)化方面的研究發(fā)展。

通過固氮微生物nifH 基因進(jìn)化樹和固氮植物enod40 基因進(jìn)化樹分析，得出的分類結(jié)果和目前的分類系統(tǒng)較為一致，可以認(rèn)為，用鄰接法分析保守固氮基因序列構(gòu)建的分子進(jìn)化樹是有意義的，本研究有助于了解各類固氮生物之間的進(jìn)化關(guān)系和不同生物的固氮機(jī)制研究。

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