胡 洲，吳毅歆，毛自朝，何月秋，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)生物多樣性應用技術(shù)國家工程研究中心，云南 昆明650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術(shù)學院，云南 昆明650201)

目前，在世界范圍內(nèi)限制農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的主要因素之一就是土壤貧瘠，肥力下降，補充作物生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)元素已成為獲得穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)不可或缺的重要措施［1］。鉀是植物營養(yǎng)所必須的大量元素之一，植物在缺鉀的情況下，產(chǎn)量低下、抗逆性差，且極易發(fā)生倒伏。

鉀長石和云母等硅酸鹽礦物，是組成地球表面巖石和土壤的主要成分(占60%以上)，地殼中鉀含量占2.35%，在所有元素中占第7 位，其中土壤含鉀量占1.16%，而土壤中95%的鉀存在于鉀長石、云母這兩大礦物中。土壤鉀主要以礦物、固定鉀、代換鉀和水溶鉀4 種形態(tài)存在，其中只有2%的代換鉀和水溶性鉀可被植物吸收利用［2］。

膠質(zhì)類芽孢桿菌(以前稱為硅酸鹽細菌)是土壤中一類特殊的革蘭氏陰性芽孢桿菌，能分解硅酸鹽和鋁硅酸鹽組成的巖石礦物，具有溶磷、解鉀及固氮能力［3－6］，尤其能將土壤中的無效鉀轉(zhuǎn)變?yōu)樗傩р?，供植物吸收利用。吳洪生等?］研究發(fā)現(xiàn)，在缺鉀土壤中施用適當硅酸鹽細菌制劑，可使土壤中速效鉀增加128.6%，使土壤、磷礦粉和沙子等3 種基質(zhì)平均速效鉀含量比對照增加160.6%。劉五星等［8－9］研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)芽孢桿菌分解土壤礦物，使可溶性鉀增加了11.97% ～13.4%，SiO2含量增加8.99% ～26.89%，認為礦物溶解能力與發(fā)酵液的粘度及其中有機酸有關(guān)。盛下放等［10－11］研究發(fā)現(xiàn)硅酸鹽細菌發(fā)酵液中可溶性鉀含量達到40 ～100 mg/L，而對照只有20 mg/L。由此可見，不同的硅酸鹽細菌其解鉀能力存在一定的差異，尋求和利用新的高效解鉀菌是提高土壤有效鉀含量和作物產(chǎn)量的重要對策。

1 材料與方法

1.1 土樣

從全國不同作物根際附近、深5 ～20 cm 處取得土樣，用無菌袋密封帶回實驗室分離硅酸鹽細菌。

1.2 培養(yǎng)基

⑴硅酸鹽細菌培養(yǎng)基:蔗糖5.0 g，Na2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO30.1 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 5.0 mg，瓊脂18.0 ～20.0，pH 7.5 ～8.5，蒸餾水1 L。

⑵無氮培養(yǎng)基(阿須貝(Ashby)培養(yǎng)基):甘露醇10.0 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

⑶種子培養(yǎng)液:可溶性淀粉5.0 g，酵母膏1.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO30.1 g，F(xiàn)eCl3·6 H2O 5 mg，pH 7.5 ～8.5，蒸餾水1.0 L。

⑷發(fā)酵培養(yǎng)液:蔗糖10.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，(NH4)2SO40.2 g，NaCl 0.1 g，CaCO30.1 g，鉀長石粉5.0 g，pH 7.2，蒸餾水1 L。

⑸牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH 7.4 ～7.6，蒸餾水1 L。

1.3 試劑

細菌的生理生化鑒定試劑參照文獻［12］。

1.4 硅酸鹽細菌的分離

在無菌條件下，稱取10 g 土樣溶于90 mL 的無菌水充分振蕩并梯度稀釋成10－2、10－3、10－4倍的土壤懸液，然后每個稀釋度各取100 μL 均勻涂布于硅酸鹽細菌培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)3 d。挑選無色、透明、半玻璃狀并富有彈性的菌落，進一步純化直至獲得純培養(yǎng)為止。最后將所獲得的純培養(yǎng)菌株轉(zhuǎn)入終濃度為25%的甘油中并密封保存于－80 ℃冰箱。

1.5 細菌鑒定

1.5.1 菌落形態(tài)鑒定 用滅菌的牙簽從活化后的菌株斜面上輕輕刮取少量菌體細胞，加到10 mL 的無菌水中混勻，梯度稀釋成10－2、10－3和10－4倍菌懸液。分別取10－3和10－4倍的菌懸液0.1 mL 涂布于硅酸鹽細菌培養(yǎng)基平板上，然后倒置于隔水式303A－5S 電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 ～5 d，待菌落長出后觀察形態(tài)。

1.5.2 菌體特征觀察 挑取在硅酸鹽細菌培養(yǎng)基平板上活化后的各株菌落進行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色，在M60 －2 －0058 e 蔡司正置顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，具體染色方法參照文獻［13］。

1.5.3 菌體的生理生化鑒定 以硅酸鹽細菌培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，參照常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊［13］對解鉀能力較強的K1 和K3 進行生理生化試驗，包括過氧化氫酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、甲基紅試驗、V－P 測定、淀粉水解試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗和耐鹽性等，參照菌株為P.mucilaginosus VKPM B －7519，由本實驗室提供。

1.5.4 菌株的16S rDNA 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 細菌DNA 提取參照Kim 和Rainey［14－15］報道的方法。利用Iversen 等［16］報道的細菌通用引物P0(5' －GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3')和P6(5' －CTACGGCTACCTTGTTACGA－3')擴增16S rDNA，PCR 反應也按其介紹的程序。

為進一步明確硅酸鹽細菌的所屬種類，細菌DNA 的提取參照Kim 和Rainey［16－17］報道的方法。利用Iversen 等［16］所報道的細菌16S rDNA 通用引物P0(5' －GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和P6(5'－CTACGGCTACCTTGTTACGA－3')進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆后，由華大基因公司完成測序。

序列比對用軟件BioEdit7.01 中的CLUSTAL W 多序列比對程序進行，系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA 5.0 軟件構(gòu)建，方法為最大相似性(maximum likelihood)，模型為Tamura－Nei model［17］，bootstrap 分析重復1 000 次。

1.6 解鉀能力的測定

挑選在無氮培養(yǎng)基上生長良好的菌株分別接種于50 mL 種子培養(yǎng)液中于37 ℃180 r/min 下擴大培養(yǎng)2 d，作為種子液。用移液槍取50 mL 種子液按4%的接種量加入50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液中，以不接任何菌液的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照組，每個處理設(shè)3 個重復，于28 ℃150 r/min 下培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液用30%的H2O2消煮至莢膜消失，在6 000 r/min 離心10 min，將上清液定容至50 mL 容量瓶中，在M410 火焰亮度計上用空白溶液調(diào)節(jié)儀器零點，以標準溶液系列中的最高濃度的標準溶液調(diào)節(jié)儀器滿刻度至40 分度處測量其他標準溶液，記錄儀器示值。具體操作參照土壤理化分析實驗指導書［18］。

1.7 盆栽試驗

將采集來的土樣自然風干，過8 目篩，裝入試驗用塑料缽，每缽裝土500 g。玉米種子用30% H2O2的消毒，于37 ℃恒溫培養(yǎng)基箱中浸種24 h，催芽后播種于溫室內(nèi)。選取解鉀能力較強菌株K1、K3、K4、K5、K6 發(fā)酵液(濃度為3 ×10－5cfu/mL)和無菌水各100 mL 分別施入各自塑料盆土壤中，每個處理3 次重復，以原土樣作為空白對照。每盆播6 ?！皶? 號”玉米種子，一周后間苗，每盆留4 株。每天定量澆水管理。其他管理條件一致。25 d 后調(diào)查玉米根長、株高、葉寬和鮮質(zhì)量，采用SPSS17.0 進行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果

在硅酸鹽細菌培養(yǎng)基平板上，挑取圓形、透明、粘稠并有一定彈性的菌落，經(jīng)過多次劃線純化分離，共獲得了8 株(K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8)疑似膠質(zhì)類芽孢桿菌。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征 分離得到的8 株菌落均呈無色、透明，半玻璃狀，邊緣整齊，表面光滑，富有彈性且易拉成絲。菌體革蘭氏染色呈陰性，桿狀或短桿狀，莢膜肥厚。該菌在37 ℃培養(yǎng)下，1 ～2 d 菌落直徑約2 mm，3 ～5 d 菌落直徑約5 mm。但其在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長不良。這些特征與對照菌株及膠質(zhì)類芽孢桿菌特征相似［19］。

圖1 K1 的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of P.mucilaginosus k1

圖2 K3 的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of P.mucilaginosus k3

2.2.2 生理生化試驗 在所有8 個菌株在生理生化試驗中，反應結(jié)果與膠質(zhì)類芽孢桿菌基本一致，表1 只列出了解鉀能力較強的K1 和K3 菌株和參照菌株P(guān).mucilaginosus VKPM B－7519 的反應型。

表1 硅酸鹽細菌的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical tests of silicate bacteria

2.2.3 菌株的16S rDNA 序列檢測及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 利用引物P0 和P6 擴增菌株K1 和K3 的16S rDNA 基因，目的片段大小與預期一致，經(jīng)測序，片段長度均為1 410 bp。K1 和K3 菌株的16S rDNA 基因已提交到GenBank，序列號分別為:KC762937 和KC762938。將序列分別與GenBank 序列相比對，結(jié)果表明，K1 和K3 菌株與類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的菌株序列同源性最高。從MEGA 5.0 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)來看，菌株K1 和K3 與所有的P.mucilaginosus 菌株聚為一支。依據(jù)16S rDNA 基因序列再次將K1 和K3 歸入P.mucilaginosus。因此，根據(jù)形態(tài)特征、生化反應特點及16S rDNA 基因序列，K1 和K3 菌株歸屬于膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)。

圖3 菌株K1 和K3 的系統(tǒng)發(fā)育學地位Fig.3 The phylogenetic dendrogram of strains K1 and K3

2.2.4 菌株的解鉀能力 搖瓶培養(yǎng)后，8 個菌株解鉀能力的測定結(jié)果(表2)表明，它們的解鉀能力存在較大差異，其中K3 的解鉀能力最強，培養(yǎng)液中可溶性鉀的含量達25.13 μg/mL，較對照組增加了56.57%;其次為K1，可溶性鉀的含量達23.78 μg/mL，較對照組增加了48.16%;其余幾株的解鉀能力都比較低。因各菌在培養(yǎng)基中的生長量相當，都在10 萬CFU/mL 數(shù)量級上，所以，可溶性鉀含量的提高未能反映菌量的增加，而是反映了解鉀能力存在很大差異。

表2 硅酸鹽細菌解鉀能力的比較Tab.2 The comparison of the ability of the silicate bacteria to release K

2.3 促生長作用

在盆栽試驗中，出苗期玉米的根長、株高、葉寬和鮮質(zhì)量等性狀測定的結(jié)果見表3。與對照相比，K3 處理對玉米促生長作用極顯著，根長、株高、葉寬和鮮質(zhì)量的凈增率分別達到了72.51%、22.81%、14.06%和198.51%。在根長和株高方面，菌株K1、K3、K5、K6 處理顯著地高于對照，但菌株K4 與對照沒有顯著差異;在鮮質(zhì)量方面，各菌株處理亦顯著地高于對照，但K5、K6 處理間沒有顯著差異;然而，各菌株處理的玉米葉片寬度與對照間無顯著差異。

表3 硅酸鹽細菌對玉米苗期的促生長效果Tab.3 Growth－promoting effect of the silicate bacteria on corn seedlings

3 結(jié)論與討論

(1)本次試驗在不同土壤中分離得到8 株類似于硅酸鹽細菌的芽孢桿菌。通過菌落形態(tài)、表型和生理生化鑒定，以及對鉀長石解鉀能力的測定，結(jié)合16S rDNA 序列分析，將K1 和K3 初步鑒定為膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)。這些菌株在硅酸鹽細菌培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與何琳燕等［20］的描述一致，表現(xiàn)出特有的生理生化性質(zhì)，賀積強等［21］也對40 株來自紫色土的硅酸鹽細菌進行了包括形態(tài)、生理生化特征等52 個表型性狀的測試，均認為硅酸鹽細菌具有生物多樣性。這將為未來硅酸鹽細菌作為生物鉀肥提供基礎(chǔ)材料。

(2)本試驗中供試的膠質(zhì)類芽孢桿菌具有一定的解鉀能力，不同菌株的解鉀能力存在差異。菌株K3 的解鉀能力最強，培養(yǎng)液中可溶性鉀的含量為:25.13 μg/g，較對照組增加了56.57%;其次菌株K1可溶性鉀的含量為:23.78 μg/g，較對照組增加了48.16%。據(jù)相關(guān)資料顯示，在缺磷源和鉀源的培養(yǎng)基中膠質(zhì)芽孢桿菌不能生長或者只能少量生長，而以不溶性磷灰石作為唯一磷源或以含鉀礦物作為唯一鉀源時，菌數(shù)分別比無磷對照增加5 000 ～12 600 倍，比無鉀對照增加3.6 ～16.5 倍，同時進行定量分析發(fā)現(xiàn)磷釋出率為0.12% ～0.18%，比空白對照水溶磷增加233% ～250%，而水溶鉀增加65% ～87%(重量法)［22－23］。由此可見，膠質(zhì)類芽孢桿菌的確具有一定的解鉀能力，篩選出具有較強解鉀能力的菌株將有利于微生物鉀肥的研究。

(3)早在20 世紀50 年代，膠質(zhì)類芽孢桿菌(過去稱為硅酸鹽細菌)菌劑(生物鉀肥)對作物的增產(chǎn)效果在前蘇聯(lián)已有廣泛研究［24］。本次試驗通過對玉米盆栽實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，K3 處理組對苗期玉米的影響最大，根長、株高、葉寬和鮮質(zhì)量的凈增率分別達到了72.51%、22.81%、14.06% 和198.51%，表現(xiàn)出顯著的差異性。在其他工作者的研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)硅酸鹽細菌在玉米、蘋果、辣椒上具有明顯的促生效果。也有相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)類芽孢桿菌對各種喜鉀作物如甘薯、煙草、棉花、水稻等有明顯的增產(chǎn)作用［25－26］。由此可見，膠質(zhì)類芽孢桿菌的確具有增產(chǎn)、促生長效果，但菌株K1 和K3 究竟適用于哪些作物，或?qū)ψ魑锸欠翊嬖谶x擇性?還有待下一步驗證。

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