丁厚康，馬衛(wèi)明 ，劉蓮蓮，于小婷，萬(wàn) 圣

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 泰安271018)

兔大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(E.coli)及其毒素引起的一種暴發(fā)性、死亡率很高的仔兔腸道性傳染病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的重大疾病之一［1］。本病無(wú)明顯季節(jié)性，以20 日齡到4 月齡仔兔易感，其中20 日齡到斷奶前后仔兔發(fā)病率最高。對(duì)于致病性大腸桿菌致病機(jī)理方面的研究現(xiàn)已達(dá)到了分子水平，但研究多集中在胃腸等消化器官，對(duì)于心臟、肝臟等實(shí)質(zhì)器官還少見(jiàn)研究報(bào)道。有研究指出，致病性大腸桿菌感染對(duì)機(jī)體的損傷不僅局限于腸道［2］，還可異位感染于腎臟［3］。為探討大腸桿菌感染對(duì)兔各實(shí)質(zhì)器官的病理?yè)p傷作用，本研究以人工感染大腸桿菌病的仔兔為研究對(duì)象，系統(tǒng)地測(cè)定了其血液生理生化指標(biāo)和實(shí)質(zhì)器官病理組織學(xué)變化，并且比較了常用抗生素和微生態(tài)制劑的治療效果，從一個(gè)新的視角探討致病性大腸桿菌對(duì)機(jī)體的病理?yè)p傷過(guò)程，為進(jìn)一步防治大腸桿菌病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)毒株 大腸埃希氏菌(CICC 編號(hào):23657)由濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局提供，使用前接種于高壓滅菌的肉湯中，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)28 h，使活菌數(shù)達(dá)到2 ×109個(gè)/mL。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(合格證號(hào):0008991，許可證號(hào):scxl 魯20080002)。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風(fēng)良好，自由采食飲水。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和主要試劑 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳市普康電子有限公司生產(chǎn));7020 型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立集團(tuán)生產(chǎn))。硫酸慶大霉素(4 萬(wàn)單位/mL，山東益康藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，乳酸菌素片(400 mg/片，哈藥集團(tuán)制藥六廠(chǎng)生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

40 只健康新西蘭兔，30 ～40 日齡，預(yù)飼1 周后隨機(jī)分為4 組，每組10 只，第1 組為正常對(duì)照組(G1)，于試驗(yàn)當(dāng)天腹腔注射無(wú)菌生理鹽水2 mL;第2 組為大腸桿菌感染組(G2)，第3 組為慶大霉素治療組(G3)，第4 組為乳酸菌素治療組(G4)，此3 組均于試驗(yàn)當(dāng)天腹腔注射大腸桿菌培養(yǎng)液2 mL，待出現(xiàn)癥狀后(注射菌液后第2 天)，G3 組每日肌注慶大霉素0.5 mL(2 U)/只，連續(xù)注射4 d，G4 組每日口服乳酸菌素片1 片(400 mg/片)，連續(xù)4 d。每組分別單室、單人飼養(yǎng)，逐日觀察體溫、精神狀態(tài)、采食和糞便等臨床癥狀。

1.3 血生理生化指標(biāo)檢測(cè)

人工感染后分別于第1、3、5 天各組隨機(jī)選取2 只，每只心臟采血5 mL，其中1 mL 注入肝素鈉抗凝管中，用于測(cè)定血液生理指標(biāo)。另外4 mL 先注入5 mL 無(wú)菌離心管中，室溫靜置0.5 h，3 000 r/min 離心5 min，分離血清，用于測(cè)定血液生化指標(biāo)。將所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0 系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 臨床病理觀察和實(shí)質(zhì)器官組織切片

常規(guī)處死實(shí)驗(yàn)兔，剖檢，觀察并記錄病理變化，之后取心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟固定于4%多聚甲醛中1 周，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE 染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔臨床癥狀和剖檢變化

圖1 G2 組兔腹瀉初期和中后期糞便對(duì)照Fig.1 The early and the late diarrheic fecal contrast in G2

人工感染后第2 天，G2、G3、G4 組仔兔均開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉癥狀，病兔精神沉郁，食欲減退或廢絕，開(kāi)始糞便粒細(xì)小、兩頭尖、成串、外有透明樣黏液，中后期糞便呈棕褐色水樣，肛門(mén)附近及后肢被毛沾滿(mǎn)稀糞(圖1);G2 組兔感染后第3 天和第4 天各有1 只死亡，第5 天精神有所好轉(zhuǎn)。第7 天耐過(guò)兔基本恢復(fù)正常。G3 和G4 組兔未見(jiàn)病兔死亡，第6 天基本恢復(fù)正常。

病兔剖檢可見(jiàn)有明顯的肝周炎、心包炎和腹膜炎癥狀，表現(xiàn)為肝臟、脾臟有大量纖維蛋白附著(圖2)，心包和腸系膜外亦有大量纖維蛋白附著，肝脾表現(xiàn)明顯的充血、淤血現(xiàn)象(圖2)，個(gè)別有出血。肺臟輕微充血，腎臟未見(jiàn)明顯病理變化。G3、G4 組兔與G2 組兔相比，第3 天剖檢病理變化相對(duì)較輕，肝臟和脾臟被膜外有少量纖維蛋白附著，肝脾充血未見(jiàn)出血;第5 天剖檢病理變化明顯減輕。正常對(duì)照組G1 剖檢未見(jiàn)異常。

圖2 G2 組兔肝臟和脾臟剖檢觀察Fig.2 The rabbit liver and spleen was observed pathological autopsy in G2

2.2 病理組織學(xué)變化

2.2.1 心臟 人工感染后第2 天，G2、G3、G4 組兔心臟組織均表現(xiàn)充血。感染后第3 天，G2 組兔可觀察到肌纖維間出血，有紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3);第5 天可觀察到心肌纖維萎縮變性，大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖3 G2 組兔心臟組織切片F(xiàn)ig.3 The rabbit heart tissue sections in G2

2.2.2 肝臟 人工感染后第2 天，G2、G3、G4 組兔均可見(jiàn)充血，肝細(xì)胞索間有纖維狀物質(zhì)。感染后第3 天，G2 組兔肝組織內(nèi)小靜脈淤血，肝細(xì)胞因淤血而萎縮，肝細(xì)胞間有紅細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維狀物質(zhì)增多(圖4)。

圖4 兔肝臟組織切片F(xiàn)ig.4 The rabbit liver tissue sections

圖5 G2 組兔肺臟組織切片F(xiàn)ig.5 The rabbit lung tissue sections in G2

圖6 G2 組兔腎臟組織切片F(xiàn)ig.6 The rabbit kidney tissue sections in G2

2.2.3 肺 人工感染后第3 天，G2 組兔肺泡毛細(xì)血管充血，出血，肺泡隔增寬，大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管黏膜呈皺褶狀突向官腔，細(xì)支氣管外密集大量炎性細(xì)胞(圖5)。

2.2.4 腎 人工感染后第3 天，G2 組兔腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性，胞漿溶解，皮質(zhì)區(qū)腎小管官腔內(nèi)充滿(mǎn)大量滲出物，腎小管間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。髓質(zhì)區(qū)腎小管水腫，部分腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生變性壞死，間質(zhì)增生纖維化，散在有局灶性壞死，間質(zhì)毛細(xì)血管充血(圖6)。

圖7 G2 組兔脾臟組織切片F(xiàn)ig.7 The rabbit spleen tissue sections in G2

2.2.5 脾 人工感染后第3 天，G2 組兔脾小體中央?yún)^(qū)的淋巴細(xì)胞發(fā)生變性壞死，紅髓內(nèi)積聚大量紅細(xì)胞和少量淋巴細(xì)胞(圖7)。

表1 兔血液生理指標(biāo)測(cè)定Tab.1 Determination of blood physiological index of rabbit (X±S，n=6)

2.3 血液生理指標(biāo)測(cè)定

SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，G2 組兔白細(xì)胞總數(shù)極顯著高于G1 組兔(P ＜0.01)，G3 組兔白細(xì)胞總數(shù)顯著高于G1 組兔(P ＜0.05)，G4 組兔白細(xì)胞總數(shù)顯著低于G2 組兔(P ＜0.05)，但仍顯著高于G1 組兔(P ＜0.05)。G3 組兔淋巴細(xì)胞極顯著高于G1 組兔(P ＜0.05)，顯著高于G2 組兔(P ＜0.05)。G2 組兔粒細(xì)胞極顯著高于G1 組兔(P ＜0.01);G4 組兔粒細(xì)胞顯著高于G1 組兔(P ＜0.05)，顯著低于G2 組兔(P ＜0.05)。G2 組兔淋巴細(xì)胞比率和中間細(xì)胞比率顯著低于G1 組兔(P ＜0.05)。G2、G4 組兔粒細(xì)胞比率顯著高于G1 組兔(P ＜0.05)。G2 組兔血紅蛋白含量和血紅蛋白濃度顯著低于G1 組兔(P ＜0.05)，G3組兔血小板分布寬度顯著高于G1 組兔(P ＜0.05)。各組間中間細(xì)胞、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞分布寬度、血小板總數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積等指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。血液生理指標(biāo)測(cè)定值見(jiàn)表1。

2.4 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，G4 組兔總蛋白顯著低于G1、G2 組兔(P ＜0.05)。G2 組兔白蛋白極顯著低于G1 組兔(P ＜0.01)，G3、G4 組兔白蛋白顯著低于G1 組兔(P ＜0.05)。G3 組兔葡萄糖顯著低于G1 組兔(P ＜0.05)。G2 組兔尿素氮和總膽固醇顯著高于G1 組兔(P ＜0.05)。G3 組兔甘油三酯顯著高于G1 組兔(P ＜0.05)。G2、G3、G4 組兔高密度膽固醇均顯著低于G1 組兔(P ＜0.05)，G3、G4 組兔與G2 組兔差異不顯著(P ＞0.05)。各組間谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、低密度膽固醇、磷酸肌酸激酶、乳酸脫氫酶、鈣、磷均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。G2 組兔血清鎂極顯著低于G1 組兔(P ＜0.01)，G4 組兔顯著低于G1 組兔(P ＜0.05)，G3、G4 組兔與G2 組兔差異不顯著(P ＞0.05)。血生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兔血液生化指標(biāo)測(cè)定Tab.2 Determination of blood biochemical indicator of rabbit(X±S，n=6)

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兔大腸桿菌病雖是一種腸道傳染病，但對(duì)心臟、肝臟、肺臟、腎臟和脾臟等實(shí)質(zhì)器官均有明顯的病理?yè)p傷作用。對(duì)心臟的病理?yè)p傷主要表現(xiàn)在心肌充血，肌纖維出血，嚴(yán)重感染可致心肌變性。對(duì)肝臟的病理?yè)p傷主要表現(xiàn)在肝臟充血、淤血、部分有出血，肝細(xì)胞因淤血而萎縮，肝細(xì)胞間有大量纖維蛋白析出。肺臟肺泡內(nèi)毛細(xì)血管充血，出血，肺泡隔增寬，肺細(xì)末支氣管塌陷，有大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。腎臟腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性，腎小管水腫，間質(zhì)毛細(xì)血管充血。脾臟白髓內(nèi)部分淋巴細(xì)胞變性壞死，紅髓內(nèi)積聚大量紅細(xì)胞和少量炎性細(xì)胞。

兔大腸桿菌感染可引起白細(xì)胞總數(shù)明顯升高，其中淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞數(shù)量明顯升高，中間細(xì)胞變化不明顯。但淋巴細(xì)胞比率和中間細(xì)胞比率降低，粒細(xì)胞比率顯著升高。白細(xì)胞系統(tǒng)主要參與機(jī)體免疫反應(yīng)，急性炎癥期間，中性粒細(xì)胞通過(guò)趨化運(yùn)動(dòng)迅速到達(dá)炎癥部位參與清除病原體的炎癥反應(yīng)。有研究表明，粒細(xì)胞比率可以反映體內(nèi)炎癥嚴(yán)重程度［4］。本實(shí)驗(yàn)大腸桿菌感染組粒細(xì)胞比率明顯升高，慶大霉素治療組粒細(xì)胞比率接近正常對(duì)照組水平，乳酸菌素治療組粒細(xì)胞比率介于大腸桿菌感染組和正常對(duì)照組之間，表明慶大霉素和乳酸菌素片均具有一定的治療效果，慶大霉素比乳酸菌素片治療效果更好一些。

紅細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)主要功能是攜帶氧，測(cè)定結(jié)果顯示感染后平均血紅蛋白濃度和血紅蛋白含量降低。大腸桿菌感染會(huì)引發(fā)嚴(yán)重腹瀉，并且食欲廢絕，飲水減少，使機(jī)體組織脫水，機(jī)體蛋白質(zhì)合成減少，加之腎臟組織損傷，重吸收減少，導(dǎo)致平均血紅蛋白濃度和血紅蛋白含量降低。

白蛋白對(duì)維持血液滲透壓有重要作用，血液中白蛋白濃度降低可能導(dǎo)致機(jī)體組織水腫［5－6］。白蛋白由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，合成后進(jìn)入血液循環(huán)而分布到周身血液及體液中。病理切片顯示，大腸桿菌對(duì)肝臟有明顯的病理?yè)p傷作用，使白蛋白的合成減少，從而導(dǎo)致血清中白蛋白的值偏低;腎臟實(shí)質(zhì)性病變會(huì)導(dǎo)致大量的白蛋白從尿液中排出，從而丟失大量的蛋白質(zhì)，也會(huì)使血清中白蛋白含量降低。反過(guò)來(lái)，白蛋白濃度降低也可以反向表明大腸桿菌感染可對(duì)肝臟、腎臟造成病理?yè)p傷。

尿素氮水平升高多由腎實(shí)質(zhì)性病變引起，病理切片顯示，感染大腸桿菌，腎小管水腫，腎小球?yàn)V過(guò)率降低，使尿素氮水平升高，與血生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果相符。

兔感染大腸桿菌后血清總甘油三脂水平明顯升高，高密度膽固醇水平明顯降低。甘油三酯升高致使血液中脂質(zhì)含量過(guò)高，導(dǎo)致血液粘稠，部分析出沉積在血管內(nèi)壁上，使血管內(nèi)徑變小，血液流速減慢，進(jìn)而發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化［7－8］。高密度膽固醇具有直接的抗動(dòng)脈硬化作用，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，靜脈內(nèi)給予高密度膽固醇及其亞類(lèi)可使兔的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊消退［9］。有研究表明，血清高密度膽固醇隨血清甘油三脂濃度的升高而遞減，甘油三酯與高密度脂蛋白膽固醇比值可以獨(dú)立估計(jì)冠心病危險(xiǎn)，兩者比值越大，發(fā)病率越高［10－11］。兔感染大腸桿菌后血清總甘油三脂水平明顯升高，高密度膽固醇水平明顯降低，兩者比值增大，患有動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的概率明顯上升。

大腸桿菌對(duì)抗生素及磺胺類(lèi)藥物等極易產(chǎn)生耐藥性。近幾年因抗生素及廣譜抗菌藥物的大量使用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使該病的發(fā)生和流行出現(xiàn)了新的特點(diǎn)，同時(shí)也給本病的防治提出了新的問(wèn)題。為尋求新的有效治療方法，微生態(tài)制劑對(duì)病原微生物性腹瀉的輔助治療效果日益成為研究的熱點(diǎn)［12］。微生態(tài)制劑中的有益菌是良好的免疫激活劑，研究表明乳酸桿菌以免疫調(diào)節(jié)因子的形式起作用［13］，刺激腸道局部型免疫反應(yīng)，提高機(jī)體抗體水平或巨噬細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。陳天游［14－15］等研究表明，枯草芽孢桿菌BS23 株對(duì)大腸埃希氏菌等6 種腸道致病菌有拮抗作用，尤其對(duì)產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌和致病性大腸埃希氏菌的抑菌作用更明顯。本研究結(jié)果顯示，乳酸菌素可以縮短病程，減少大腸桿菌感染對(duì)實(shí)質(zhì)器官的損害和對(duì)血生理生化指標(biāo)的影響，說(shuō)明乳酸菌素片對(duì)治療兔的大腸桿菌感染有一定效果，可以作為治療兔大腸桿菌病的輔助用藥。

綜上所述，研究大腸桿菌對(duì)仔兔機(jī)體的影響，比較抗生素與生物活性物質(zhì)作用效果，對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制研究和畜牧業(yè)生產(chǎn)有較大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

［1］劉蓮蓮，馬衛(wèi)明，丁厚康，等.大腸桿菌對(duì)仔兔小腸形態(tài)學(xué)影響及其治療方法的比較［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(1):124 －128.

［2］沈琴芳，何世成，張秀亮，等.兔大腸桿菌導(dǎo)位感染的診斷及病原鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004，47(6):43.

［3］丁衍濤，丁葉，佘銳萍，等. 大腸桿菌感染對(duì)家兔腎臟組織結(jié)構(gòu)及iNOS 表達(dá)的影響［J］. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26(9):37 －39.

［4］白雪梅，楊平，王瑩，等.外周血中性粒細(xì)胞百分率在小兒急性上呼吸道感染中的應(yīng)用［J］. 臨床兒科雜志，2005，23(9):664 －666.

［5］溫靖，顧為望，楊海英，等.SPF 級(jí)新西蘭兔血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(1):81 －83.

［6］俞春英，謝金東，李秀紅，等.福建黃兔血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定［J］.經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，13(2):83 －86.

［7］張代民，張瑩，李霆，等.血清甘油三酯/高密度脂蛋白膽固醇比值對(duì)冠心病的診斷價(jià)值［J］.現(xiàn)代診斷與治療，2006，17(2):68 －69.

［8］林旻潔，趙水平.甘油三酯與冠心病發(fā)病關(guān)系及機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2011，19(12):1043 －1046.

［9］Lien W P，Lai L P，Shyu K G，et al. Low-serum，high-density lipoprotein cholesterol concentration is an important coronary risk factor in Chinese patients with low serum levels of total cholesterol and triglyceride［J］. American J Cardiol，1996，77(12):1112 －1115.

［10］Barter P J，Rye K A.High density lipoproteins and coronary heart disease［J］.Atherosderosis，1996，121(1):1 －12.

［11］Reaven G.Metabolic syndrome，pathophy siology and implications for management of cardiovascular disease［J］.Circulation，2002，106(3):286 －288.

［12］王君耀，趙鋒.3 種微生態(tài)制劑與常用抗菌藥物的相互作用［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23(7):419 －419.

［13］胡東興，潘康成.微生態(tài)制劑及其作用機(jī)理［J］.中國(guó)飼料，2001，1(3):14 －16.

［14］陳天游，董思國(guó)，田萬(wàn)紅，等.枯草芽孢桿菌活菌體外拮抗6 種腸道致病菌的研究［J］. 微生物學(xué)雜志，2004，24(5):74 －76.

［15］尹清強(qiáng)，李小飛，常娟，等.微生態(tài)制劑對(duì)哺乳和斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響及作用機(jī)理研究［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(4):622 －630.