孟麗峰，靳三省，刁青云

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蜜蜂研究所，北京100093)

糖類是蜜蜂生長發(fā)育所需碳水化合物和能量的主要來源，在維持蜂群健康、個體免疫能力和工蜂分工方面起著重要作用［1］。在自然條件下蜜蜂主要采集植物花蜜、蜜露等，經(jīng)過一系列復(fù)雜的過程，最終轉(zhuǎn)化成主要含果糖和葡萄糖的物質(zhì)貯存在蜂巢中。養(yǎng)蜂者為了刺激蜜蜂繁育達(dá)到壯群的目的，經(jīng)常獎勵飼喂白砂糖。此外，在蜜源枯竭、冬季越冬期間也必須人工飼喂白砂糖，維持群勢。白砂糖是蜜蜂飼養(yǎng)過程中主要的人工飼料糖。

近年來，隨著白砂糖價格的持續(xù)高漲，養(yǎng)蜂者已經(jīng)開始使用果葡糖漿代替蔗糖進(jìn)行冬季飼喂。果葡糖漿主要由酶法轉(zhuǎn)化玉米淀粉得到，玉米淀粉在α－淀粉酶的作用下生成麥芽低聚糖，麥芽低聚糖在淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶的作用下生成液化葡萄糖，在葡萄糖異構(gòu)酶的作用下，一部分葡萄糖生成果糖，最終形成由葡萄糖和果糖組成的混合糖漿［2－3］，果葡糖漿甜度和蔗糖接近，高濃度下不易結(jié)晶，偏酸性，不易發(fā)酵有利于儲存，價格低廉，經(jīng)常用作蜜蜂的飼料。目前對于果葡糖漿飼喂蜜蜂的風(fēng)險性評估還較少，特別是機(jī)理更不清楚。Barker 等［4］報道，以蜂蜜為對照，飼喂果葡糖漿對蜜蜂的壽命沒有影響，但是果糖在有機(jī)酸和礦物質(zhì)的作用下水解產(chǎn)生羥甲基糠醛，對蜜蜂是有毒的，使蜜蜂壽命縮短，出現(xiàn)類似痢疾的癥狀。王文祥等［5］研究發(fā)現(xiàn)飼喂果葡糖漿和飼喂白砂糖對意大利蜜蜂王臺接受率、單個王臺產(chǎn)漿量、蜂王初生體質(zhì)量和工蜂體內(nèi)的兩種氧化酶Cu－Zn SOD 和CAT 的mRNA 表達(dá)量均無顯著差異。然而，飼喂果葡糖漿對于蜜蜂體內(nèi)解毒酶的影響還處于空白。本文以意大利蜜蜂體內(nèi)3 種主要的解毒酶細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶(GSTs)為研究對象，比較飼喂果葡糖漿和蔗糖對意大利蜜蜂解毒酶的影響，以明確果葡糖漿對蜜蜂的安全性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試?yán)ハx 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)。

1.1.2 實驗用糖 果葡糖漿(江西天禾糖業(yè)發(fā)展有限公司，F(xiàn)42);蔗糖(廣西華盛集團(tuán)露躺糖業(yè)有限責(zé)任公司糖廠，一級)。

1.1.3 試劑及儀器 還原型輔酶Ⅱ四鈉鹽(NADPH)、二硫蘇糖醇(DTT)含量均大于99%，購自Biomol公司;7 －羥基香豆素(7 －Hydroxycoumarin)98%、考馬斯亮藍(lán)G250、固藍(lán)B 鹽Fluka 公司產(chǎn)品;α －乙酸萘酯(α －NA)、毒扁豆堿、十二烷基硫酸鈉(SDS)、谷胱甘肽(GSH)、1，1 －二氯 －2，4 － 二硝基苯(CDNB)、均為Sigma 公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白(BSA)購自北京同正生物公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)99%，購自德國Merck 公司;Tris－base 美國Promega 公司產(chǎn)品;甘油、鹽酸、氯化鉀、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甘氨酸(Gly)、三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、無水乙醇、96%乙醇，均為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

5417R 型高速離心機(jī)(德國eppendoff 公司產(chǎn)品)，SPH－100B 型恒溫振蕩器(上海世平實驗設(shè)備公司產(chǎn)品)，LS55 型熒光分光光度計(英國Perkin Elmer 公司產(chǎn)品)，UV2200 紫外可見分光光度計(上海天普分析儀器有限公司產(chǎn)品)，Lambda Bio－45 紫外－可見分光光度計(美國Perkin－Elmer 公司產(chǎn)品)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂群飼養(yǎng)管理 選用群勢一致的健康意大利蜜蜂10 群，隨機(jī)分成2 組，每組5 群，處理組飼喂果葡糖漿，對照組飼喂蔗糖。試驗期間，外界缺少蜜源，定期檢查蜂群并進(jìn)行飼喂，以保證蜂群內(nèi)有充足的食物，其它飼養(yǎng)條件(如自由采水、防病等)也調(diào)整一致。飼喂果葡糖漿兩個月后，開始取樣。成年工蜂取樣后放置于溫度33 ℃、相對濕度70%的培養(yǎng)箱中饑餓4 h 后，進(jìn)行酶液制備。

1.2.2 酶液制備 CarE 酶液的制備方法:取意大利蜜蜂腹部加入預(yù)冷的pH 7.0，0.04 mol/L 的磷酸緩沖液中，冰浴勻漿，4 ℃，10 800 r/min 離心10 min，取上清液，在預(yù)冷的抽濾瓶內(nèi)用兩層濾紙抽濾，濾液作為CarE 測定的粗酶液，剩余酶液貯存于－20 ℃冰箱用于蛋白含量的測定。

GSTs 酶液的制備方法:同CarE 的制備，所需緩沖液為pH 6.5 的磷酸緩沖液。

細(xì)胞色素P450 酶液的制備，參照于彩虹和高希武［6］的方法:取蜜蜂大幼蟲加入預(yù)冷的pH 7.50，1 mol/L的磷酸緩沖液(含50 mmol/L DDT，50 mmol/L PMSF，1 mmol/LEDTA，10%甘油)冰浴勻漿，4 ℃，10 800 r/min離心10 min，取上清液，在預(yù)冷的抽濾瓶內(nèi)用兩層濾紙抽濾，濾液作為P450 測定的粗酶液，剩余酶液貯存于－20 ℃冰箱用于蛋白含量的測定。

1.2.3 細(xì)胞色素P450O－脫乙基活性測定 參考Hung 和Sun［7］的方法，利用熒光分光光度計檢測細(xì)胞色素P450 對底物7 －乙氧基香豆素的脫乙基活性，通過其產(chǎn)物7 －羥基香豆素的熒光變化值來確定酶的活性。反應(yīng)體系:1 mL 反應(yīng)體系，含0.1 mol/L 的Tris －HCl，10 mmol/L 的NADPH 和7 － 乙氧基香豆素，原酶液，37 ℃，220 轉(zhuǎn)恒溫振蕩器反應(yīng)15 min，15%三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，10 800 r/min離心

1 min。用移液槍吸取1 mL 注入比色皿，加入450 μL 甘氨酸－氫氧化鈉(Gly －NaOH)，搖勻，在34 ℃條件下測定熒光值。所有的實驗均在室溫條件下進(jìn)行，每一個實驗重復(fù)3 次。

1.2.4 CarE 活力的測定 參照Hama 等［8］比色測定法:反應(yīng)體系3.7 mL，包括0.04 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液，3 ×10－2mol/L α － 乙酸萘酯(內(nèi)含毒扁豆堿，終濃度3 ×10－4mol/L)，原酶液，30 ℃水浴下反應(yīng)15 min，加入顯色劑(1%固藍(lán)B 鹽和5%SDS 以2∶5 混合)終止反應(yīng)，對照加入等量緩沖液代替原酶液。15 min 后在600 nm 下測定吸光度值。所有的實驗均在室溫條件下進(jìn)行，每1 個實驗重復(fù)3 次。

1.2.5 GSTs 活性的測定 參照Habig 等［9］方法，反應(yīng)體系900 μL:包括pH 6. 5 磷酸緩沖液，30 mmol/LGSH，30 mmol/L CDNB，適量酶液，在25 ℃恒溫下于340 nm 波長處，用時間驅(qū)動程序測定其吸光值在2 min 內(nèi)的變化值。所有的實驗均在室溫條件下進(jìn)行，每1 個實驗重復(fù)3 次。

1.2.6 酶源蛋白含量測定 采用Bradford 考馬斯亮藍(lán)G－250 法(Bradford，1976)［10］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)都用SPSS 軟件進(jìn)行分析，方法用成組法t 檢驗(Two －Samples T－Test)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂果葡糖漿對蜜蜂大幼蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450 的影響

如圖1 所示:以蔗糖為對照，用果葡糖漿飼喂蜜蜂2 個月后，蜜蜂大幼蟲體內(nèi)的細(xì)胞色素P450 比活力為0.20［pmol/(min·mgPro)］，蔗糖組P450 比活力為0.19［pmol/(min·mgPro)］，較對照組活性有所升高但是與對照組差異不顯著(P=0.098 ＞0.05)。

柱形圖上方小寫字母a 表示差異不顯著。The letter a on the bars indicate that the means are not significant between the treatment and the control.圖1 果葡糖漿對蜜蜂大幼蟲P450 活性的影響Fig.1 Effects of high fructose syrup diet on the activities of the P450 in larvae.

柱形圖上方小寫字母a 表示差異不顯著。The letter a on the bars indicate that the means are not significant between the treatment and the control.圖2 果葡糖漿對意大利蜜蜂CarE 的影響Fig.2 Effects of high fructose syrup diet on the activities of CarE in honeybees Apis mellifera ligustica

2.2 飼喂果葡糖漿對蜜蜂工蜂腹部CarE 的影響

如圖2 所示飼喂果葡糖漿兩個月后，蜜蜂腹部的CarE 比活力為3.2［mmol/(min·mg·Pro)］，蔗糖組酶比活力為2.8［mmol/(min·mg·Pro)］，和對照組比較，飼喂果葡糖漿后蜜蜂腹部的CarE 活性升高但是與蔗糖組差異不顯著(P =0.707 ＞0.05)。

2.3 飼喂果葡糖漿對蜜蜂工蜂腹部GSTs 的影響

如圖3 所示，飼喂果葡糖漿后蜜蜂腹部GSTs的比活力為0.42［mmol/(min·mg·Pro)］，對照比活力為0.43［mmol/(min·mg·Pro)］，果糖漿對蜜蜂腹部的GSTs 活性無顯著影響(P =0.179 ＞0.05)。GSTs 屬于第2 階段解毒酶，CarE 和P450都屬于第1 階段水解酶，由以上結(jié)果可以得出:果葡糖漿在一定程度上能夠提高第1 階段水解酶的比活力，但是對第2 階段解毒酶無影響。

柱形圖上方小寫字母a 表示差異不顯著。The letter a on the bars indicate that the means are not significant between the treatment and the control.圖3 果葡糖漿對意大利蜜蜂GSTs 的影響Fig.3 Effects of high fructose syrup diet on the activities of GSTs in honeybees Apis mellifera ligustica

3 討論

近年來，由于蔗糖價格不斷上漲，果葡糖漿被大量用于蜜蜂飼喂，但是有不少養(yǎng)蜂者反應(yīng)，用果葡糖漿代替白砂糖喂蜂后出現(xiàn)了群勢變?nèi)趸蛘咭娐巡灰娤x的現(xiàn)象［11］。果葡糖漿F42 飼喂熊蜂后對蜂王壽命、蜂王后期的產(chǎn)卵率、工蜂始出日、轉(zhuǎn)箱率、成群率、產(chǎn)出新王數(shù)等無顯著影響，但是顯著降低了新生熊蜂蜂王的體重及大?。?2］。Severson 等［13］發(fā)現(xiàn)飼喂果葡糖漿后春季封蓋子的數(shù)量顯著低于飼喂蔗糖組，但是對蜂群的群勢和新出房工蜂的體重?zé)o顯著影響。其原因可能是果葡糖漿在制作的過程中水解不徹底，生成一些低聚糖，而蜜蜂不能消化吸收低聚糖造成的。此外，也有可能是果葡糖漿中的羥甲基糠醛造成的。

細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶是昆蟲體內(nèi)普遍存在的3 種主要的解毒酶。和其它昆蟲比較，蜜蜂具有較少的編碼解毒酶的基因，但是這些解毒酶在蜜蜂代謝殺蟲劑、植物化學(xué)物質(zhì)、真菌毒素等方面起著重要的作用［14－15］，其中目前研究發(fā)現(xiàn)最重要的一種酶是細(xì)胞色素P450，它在蜜蜂代謝花粉、花蜜中存在的植物化學(xué)物質(zhì)起著重要的作用，是蜜蜂對氟胺氰菊酯、擬除蟲菊酯等農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的主要原因［16－17］。本實驗結(jié)果表明:飼喂果葡糖漿2 個月后，對蜜蜂大幼蟲體內(nèi)的細(xì)胞色素P450 活性無顯著影響，與Johnson 等［18］對蔗糖、果葡糖漿、蜂蜜等不同的蜜蜂飼料對蜜蜂體內(nèi)P450 活性無影響的結(jié)果一致。王文祥等［5］研究表明分別給意大利蜜蜂飼喂果葡糖漿和飼喂白砂糖，兩組的王臺接受率、單個王臺產(chǎn)漿量、蜂王初生體質(zhì)量和工蜂抗氧化酶基因mRNA 的表達(dá)量均無顯著差異。本實驗結(jié)果表明，飼喂果葡糖漿對蜜蜂體內(nèi)的3 大解毒酶均無顯著影響，但是果葡糖漿在一定程度上能夠誘導(dǎo)第1 階段解毒酶CarE 和P450 的表達(dá)，這可能與果葡糖漿水解不徹底有關(guān)。

飼喂果葡糖漿對蜂群的影響存在著季節(jié)性，秋天飼喂果葡糖漿后，春季蜂群中封蓋子數(shù)量比飼喂蔗糖的少，但是如果在春季飼喂果葡糖漿則不影響后期封蓋子的數(shù)量，奧地利養(yǎng)蜂者發(fā)現(xiàn)在7 月份和10 月份之間飼喂果葡糖漿對蜜蜂越冬的死亡率無不良影響［19］。唐曉偉［20］對意大利蜜蜂P450隨季節(jié)的變化規(guī)律研究發(fā)現(xiàn):春季解毒酶的活性高于秋季，這可能是果葡糖漿對蜜蜂的影響存在季節(jié)性的一個原因。

果葡糖漿在有機(jī)酸和高溫的作用下很容易生成羥甲基糠醛(HMF)，蜂蜜在長時間的儲存過程中也可以產(chǎn)生HMF［21］。近年來已有研究表明:羥甲基糠醛對蜜蜂是有毒的。此外，隨著HMF 產(chǎn)生的乙酰丙和甲酸對蜜蜂也是有毒的，其毒性和HMF 接近［22］，但是目前并未發(fā)現(xiàn)HMF 對蜜蜂體內(nèi)解毒酶影響的報道。Jachimowicz 等［23］研究發(fā)現(xiàn):在實驗室條件下，飼喂150 μL/L HMF 的蜜糖溶液20 d 后，蜜蜂的死亡率為58.7%，同樣條件下，飼喂30 μL/L HMF 溶液對蜜蜂的存活率無顯著影響，因此，當(dāng)糖飼料中含有的HMF 小于30 μL/L 時被認(rèn)為對蜜蜂是安全的。LeBlance 等［24］用高效液相色譜測定了美國市面上果葡糖漿中HMF 的含量是28.7 μL/L。因此，合格的果葡糖漿是可以用于蜜蜂飼喂的，但是果葡糖漿在40 ℃下貯存69 d HMF 的含量可以達(dá)到250 μL/L，因此，果葡糖漿一定要合理的儲存。

通過本實驗和前人的研究得出:生產(chǎn)合格的果葡糖漿是可以喂蜂的，飼喂果葡糖漿2 個月對蜜蜂體內(nèi)的解毒酶、抗氧化酶和蜜蜂的壽命等方面并無顯著影響。長期飼喂對蜜蜂生長、群勢、生產(chǎn)能力、解毒能力等方面的影響還有待于繼續(xù)研究。

本實驗結(jié)果表明:以蔗糖作為對照，飼喂果葡糖漿對蜜蜂體內(nèi)的3 大解毒酶均無顯著影響，但是對第1 階段解毒酶CarE、P450 和第2 階段解毒酶GSTs 影響不同，本實驗結(jié)果為果葡糖漿能否飼喂蜜蜂提供了理論依據(jù)，從生化水平上說明了優(yōu)質(zhì)、生產(chǎn)合格的果葡糖漿是可以喂蜂的，為果葡糖漿飼喂蜜蜂的風(fēng)險性評估提供參考數(shù)據(jù)。

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