周霖，王華明，福軍亮，陳艷，李元元，陳黎明，呂颯，王福生

既往對CD4+T細(xì)胞的關(guān)注，主要集中于其在特異性免疫應(yīng)答中的輔助功能，如通過分泌不同的細(xì)胞因子參與和調(diào)節(jié)體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，而有關(guān)CD4+T細(xì)胞殺傷功能的相關(guān)研究結(jié)果都來自于體外培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞系或者細(xì)胞克隆[1-3]。最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人體外周血中都可不經(jīng)誘導(dǎo)直接檢測到一群表達(dá)殺傷性顆粒的CD4+T細(xì)胞，并且這群細(xì)胞通過顆粒酶和穿孔素途徑發(fā)揮了直接的溶細(xì)胞作用。但目前對CD4+殺傷性T細(xì)胞(CTL)在人類疾病中的數(shù)量變化特點(diǎn)了解尚不夠深入。基于此，我們對原發(fā)性肝細(xì)胞癌(primary hepatocellular carcinoma，PHCC)患者外周血中的CD4+殺傷性T細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了比較分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入選病例為2009年10月－2011年9月解放軍302醫(yī)院收治的臨床確診為PHCC的患者99例，同時納入年齡性別匹配的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者28例，健康對照40例。各組患者和健康對照的基本情況見表1。所有PHCC病例均為在慢性乙型肝炎基礎(chǔ)上合并肝癌。肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2001年9月第8屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議(廣州)制定的原發(fā)性肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010年《慢性乙肝防治指南》[5]。所有病例及對照均經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb，并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等。同時行血常規(guī)、肝功能檢測。入組所有病例及對照均簽署知情同意書。

表1 各組患者和健康對照一般情況Tab.1 General information of subjects enrolled in present study

1.2 主要試劑和儀器 流式細(xì)胞儀(Calibur型)、CD3-PerCP、CD4-APC、顆粒酶A-FITC、顆粒酶BFITC、穿孔素-FITC、破膜劑均購自美國BD公司。乙肝病毒血清標(biāo)志物ELISA檢測試劑盒由北京科衛(wèi)試劑有限公司提供。

1.3 CD4+CTL檢測方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測顆粒酶A、B及穿孔素陽性的CD4+T細(xì)胞，即為CD4+CTL。同時取3份新鮮分離的PBMCs各5×105個置于流式管，加入PBS洗滌1遍后懸于200μl PBS，加入熒光標(biāo)記抗體CD3-PerCP、CD4-APC，4℃避光孵育20min，PBS洗滌1次，加入破膜劑300μl，4℃避光30min，離心后棄上清，加入破膜洗液1ml，洗滌后，分別加入顆粒酶A-FITC、顆粒酶B-FITC、穿孔素-FITC，4℃避光孵育20min，破膜洗液洗滌1次后懸于200μl PBS，1%多聚甲醛固定，4℃保存，24h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)用CELLQuest軟件收獲細(xì)胞并分析。

1.4 不同人群外周血CD4+CTL的比較 PHCC患者99例、CHB患者28例和健康對照40例，均取外周血5ml，按1.3的方法進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CTL和CD4+T細(xì)胞總數(shù)，計算CD4+CTL所占比例。

1.5 不同分期PHCC患者外周血CD4+CTL的比較

根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]將99例PHCC患者分為早期(Ⅰ期，n=29)、中期(Ⅱ期，n=36)、進(jìn)展期(Ⅲ期，n=34)3組。檢測患者CD4+CTL和CD4+T細(xì)胞總數(shù)，計算CD4+CTL所占比例，比較早、中期和晚期患者細(xì)胞比例的差異。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。不同人群和不同分期PHCC患者外周血CD4+CTL的比例為計量資料，滿足正態(tài)分布，以s表示。健康對照、CHB患者及PHCC患者表達(dá)顆粒酶A、B和穿孔素的細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例以百分率表示，由于3組方差不齊，故采用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PHCC、CHB和健康對照組外周血CD4+CTL比例的比較 統(tǒng)計學(xué)分析顯示，PHCC患者外周血表達(dá)顆粒酶A、B和穿孔素的細(xì)胞比例顯著高于CHB組和健康對照組(P＜0.05)，其余兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2，圖1)。

2.2 不同分期PHCC患者外周血CD4+CTL比例的比較 隨疾病進(jìn)展，CD4+CTL占CD4+T細(xì)胞的比例顯著下降。各期患者CD4+CTL的比例和統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見表3。

3 討 論

近年來越來越多的證據(jù)顯示CD4+CTL可能通過殺傷作用發(fā)揮重要的抗腫瘤作用[6-7]。但是CD4+CTL在人類腫瘤中的研究較少，尤其是其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的變化情況國內(nèi)鮮見報告。本研究通過直接檢測CD4+CTL顆粒酶和穿孔素的表達(dá)來鑒定CD4+CTL，可以更為精確地反映CD4+CTL的數(shù)量，并方便觀察其在肝癌中的變化特點(diǎn)[1-3]。

表2 外周血顆粒酶A、B和穿孔素陽性CD4+ CTL細(xì)胞比例Tab. 2 Proportion of Granzyme A+, Granzyme B+ and perforin CD4+ cytotoxic T lymphocytes in peripheral blood of patients with NC, CHB or PHCC

圖1 外周血CD4+ CTL細(xì)胞典型流式細(xì)胞圖Fig. 1 Typical figure of flow cytometry showing CD4+cytotoxic cells in peripheral blood

慢性HBV感染及其引起的長期反復(fù)肝臟炎癥損傷，導(dǎo)致了慢性肝炎向肝硬化和肝癌進(jìn)展[8]。既往研究證實(shí)，與健康人相比，CHB患者CD4+CTL數(shù)量的增加并無統(tǒng)計學(xué)意義[9]，本研究也并未發(fā)現(xiàn)CHB患者和健康對照之間存在顯著差異。所以，我們認(rèn)為HBV感染并非引起HCC患者CD4+CTL數(shù)量增加的主要原因，而腫瘤發(fā)生很可能是首要原因。另外，傳統(tǒng)殺傷性細(xì)胞如CD8+CTL、NK細(xì)胞等的功能受抑有可能誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)充性反饋，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞表達(dá)殺傷性顆粒，行使殺傷功能。

有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織內(nèi)96%的淋巴細(xì)胞處于無反應(yīng)狀態(tài)，只有很少的CD8+T細(xì)胞表達(dá)顆粒酶和穿孔素[10-11]。本實(shí)驗(yàn)室既往研究也證實(shí)，肝癌患者的NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的殺傷功能可能受Treg的抑制[11-12]。早在10多年前，Williams等[13]就發(fā)現(xiàn)在缺少活化的CD8+T細(xì)胞的情況下，CD4+T細(xì)胞能夠引發(fā)穿孔素依賴的殺傷作用。

表3 PHCC各期患者外周血CD4+ 殺傷性T細(xì)胞頻率Tab. 3 Proportion of Granzyme A+, Granzyme B+ and perforin+ CD4+ cytotoxic T lymphocytes in peripheral blood of PHCC patients at different stages

研究顯示，在慢性病毒性肝炎和自身免疫性疾病中，長期慢性炎癥可能是誘導(dǎo)CD4+CTL生成的重要原因[2,12]，而炎癥也貫穿著腫瘤性疾病發(fā)生發(fā)展的全過程，與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[14-16]。因此，炎癥導(dǎo)致的免疫活化可能是PHCC患者CD4+CTL數(shù)量增加的重要原因之一。

在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)早期肝癌患者CD4+CTL數(shù)量升高，但隨疾病進(jìn)展，其數(shù)量反而顯著減少。我們推測，在腫瘤發(fā)生早期，機(jī)體免疫監(jiān)視功能發(fā)揮作用，誘生CD4+T細(xì)胞的殺傷功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。但隨著疾病進(jìn)展，腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制增強(qiáng)，機(jī)體抗腫瘤免疫功能逐漸削弱，CD4+CTL的數(shù)量也隨之減少。當(dāng)然，這一推測還需大量的研究工作來證明。

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