李曉燕，房潔，張紅明，韓淑芳，高玉琪，晉群

抵抗素樣分子α(found in inflammatory zone 1，F(xiàn)IZZ1)是一種與炎癥相關(guān)的缺氧誘導有絲分裂因子，在小鼠慢性低氧肺模型中顯著高表達，因此也被稱為低氧誘導的有絲分裂因子(hypoxia- induced mitogenic factor，HIMF)[1]。在缺氧、炎癥等狀態(tài)下，外周血的單核細胞和激活的巨噬細胞中FIZZ1表達顯著升高[2]。FIZZ1具有刺激肺動脈平滑肌細胞增殖、收縮血管、促進肺微血管新生和刺激肌纖維母細胞分化等功能[3-4]。有研究表明，F(xiàn)IZZ1可促進內(nèi)皮細胞分泌血管細胞黏附分子1(VCAM-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[5]，故推測其可能具有促進內(nèi)皮細胞血管新生的作用。血管新生指在原有血管基礎(chǔ)上通過內(nèi)皮細胞增殖和分化，以芽生或非芽生的形式生成血管，雖然在很多情況下血管新生能改善組織器官供血，但粥樣斑塊內(nèi)的血管新生可促進穩(wěn)定型斑塊向不穩(wěn)定型斑塊發(fā)展，如果發(fā)生在冠狀動脈則可能危及生命，引起急性心肌梗死。本研究利用重組FIZZ1蛋白刺激體外培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞(RAECs)，采用動脈內(nèi)皮細胞管腔形成實驗以及全基因表達譜芯片分析的方法，探討FIZZ1對內(nèi)皮細胞血管新生的影響及其機制，以期為冠心病的診治提供思路。

1 材料與方法

1.1 動物來源和主要儀器試劑 健康3～4周齡Wistar大鼠，體重80～100g，由山東大學齊魯醫(yī)院心血管研究中心動物房提供。ECM液體培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清、0.25%細胞消化胰蛋白酶溶液(美國Gibco公司)；肝素、明膠(美國Sigma公司)；兔抗大鼠CD31抗體(北京博奧森公司)；SABC-Cy3試劑盒(武漢博士德公司)；重組FIZZ1(美國Santa Cruz公司)；Matrigel膠(美國BD公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)；雜交爐、Agilent掃描儀(G2565B)、單標Agilen大鼠全基因表達譜4×44K芯片(美國Agilent公司)；分光光度計(ND1000，美國Nanodrop公司)。

1.2 方法

1.2.1 動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定 采用貼塊法。Wistar大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(10mg/ml)麻醉成功后，注射肝素鈉(100U/ml)0.5ml，切開腹腔，游離主動脈，將其浸泡于含1000U/ml肝素鈉和20%FBS的ECM培養(yǎng)基中。去除殘余的血管鞘脂肪和結(jié)締組織，并將其剪成寬約2mm的血管環(huán)，置于2%明膠預(yù)包被的培養(yǎng)皿中，加入含有20%FBS、100U/ml青霉素G、100μg/ml鏈霉素、100U/ml肝素鈉的DMEM培養(yǎng)基，置于50%CO2(V/V)、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%～90%融合時，采用0.25%胰酶消化法進行傳代培養(yǎng)。取動脈內(nèi)皮細胞爬片，以CD31(1:200)作為一抗，采用SABC法進行免疫熒光染色(Cy3標記，紅色熒光)。熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。實驗采用3～5代細胞。

1.2.2 動脈內(nèi)皮細胞管腔形成實驗 重組FIZZ1蛋白用含1%FBS的ECM培養(yǎng)基溶解，用于以下分組實驗。①A組：對照組，含1%FBS的ECM；②B組：單倍FIZZ1刺激組，終濃度為5×10–9mol/L；③C組：2倍FIZZ1刺激組，終濃度為1×10–8mol/L；④D組：4倍FIZZ1刺激組，終濃度2×10–8mol/L。將300μl的Matrigel涂于24孔細胞培養(yǎng)板底部，37℃培養(yǎng)1h使其成膠。選擇生長旺盛、80%～90%融合生長的RAECs消化備用。用含1%FBS的ECM培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為2×105/ml，將細胞懸液加入鋪有Matrigel的24孔板中，每孔500μl。按前述分組分別加入相應(yīng)濃度的FIZZ1和含1%FBS的ECM，每組設(shè)3個復孔，將24孔板放入培養(yǎng)箱中，6h后觀察，24h后倒置顯微鏡(×200)下觀察管腔形成情況并拍照。每孔隨機選取5個視野計數(shù)管腔形成數(shù)，取平均值進行分析。

1.2.3 動脈內(nèi)皮細胞全基因表達譜檢測 總RNA的提取、純化：將RAECs以4×105/孔的密度接種至6孔板，培養(yǎng)24h后換用無血清培養(yǎng)基靜止24h，然后根據(jù)組別施加不同干預(yù)：①正常對照組，用等量含10%FBS的ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；②FIZZ1刺激組(后稱實驗組)：用終濃度為5×10–9mol/L的FIZZ1刺激培養(yǎng)細胞，12h后吸出培養(yǎng)液停止刺激。加Trizol分別提取以上兩組RAECs的總RNA，使用苯酚/氯仿層相分離法純化總RNA，再對其進行沉淀和洗滌。分別將兩組的總RNA等量完全溶解于Mili-Q水中，－80℃凍存待用。

cRNA標記與合成：運用反轉(zhuǎn)錄法熒光標記提取的樣本RNA，均用Cy3單標標記。具體步驟如下：向去RNA酶EP管(1.5ml)中分別加入實驗組及正常對照組標本RNA各2μg，加入引物5μl，用RNase-free水補足至11.5μl，充分混勻，60℃水浴10min，冰水冷卻5min。再分別加入DDT(濃度為100mmol/L) 2μl、DNTP 1μl、Buffer 4μl、RNase OUT 0.5μl，MMLV RT 1μl，共計8.5μl，混勻、離心，熱蓋65℃、40℃反應(yīng)2h，以合成各組cRNA。然后用aaUTP標記合成的cRNA，并通過Raeasy Mini Kit(Qiagen)純化。

芯片掃描和數(shù)據(jù)處理：芯片雜交結(jié)果采用Agilent G2565B熒光掃描儀進行掃描，Agilent Feature Extraction (Version 10.7.3.1)軟件讀取數(shù)據(jù)，掃描儀分辨率為5μm，光電歐聯(lián)管分別設(shè)置為100%和10%各掃描1次，其掃描結(jié)果由Agilent軟件自動合并，所得結(jié)果采用Feature Extraction進行均一化處理。實驗組和正常對照組芯片的平均信號強度與平均背景的比值均大于3，符合Agilent基因表達譜芯片的成功標準。確定差異表達的基因，篩選兩個樣本之間的倍數(shù)變化。默認閾值≥2.0倍。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，Matrigel小管形成實驗所得的小管數(shù)以s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。基因芯片所得的差異基因利用GeneSpring GX Version 11.5.1軟件包(Agilent Technologies)進行標準化和聚類分析，采用Gene Ontology(http://www.ncbi.nlm.nib.gov)功能分類標準對差異基因進行功能分類分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組FIZZ1對RAECs管腔形成的影響 由圖1可見，重組FIZZ1能明顯促進RAECs體外血管新生管腔的形成，且在5×10–9～2×10–8mol/L實驗濃度內(nèi)呈劑量依賴性，以2×10–8mol/L FIZZ1作用最明顯。A、B、C、D組形成的管腔數(shù)目分別為19.7±2.6、22.6±2.9、28.5±3.3、36.9±5.0個/HP，各實驗組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2 全基因表達譜芯片雜交及生物信息學分析結(jié)果 實驗組及正常對照組芯片雜交結(jié)果分別采用Agilent G2565B熒光掃描儀進行掃描，結(jié)果提示有明顯差異(圖2)。利用軟件包對差異表達基因進行標準化和聚類分析后發(fā)現(xiàn)22條有顯著性差異的信號通路，包括活性上調(diào)信號通路12條，如調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架通路[regulation of actin cytoskeleton pathway(rno04810)]等，活性下調(diào)信號通路10條，如上皮細胞細菌侵入通路[bacterial invasion of epithelial cells(rno05100)]等。表1和表2列出實驗組活性上調(diào)及下調(diào)最顯著的前5個信號通路及其相應(yīng)功能和基因。

圖1 各組RAECs體外新生血管管腔形成(×200)Fig. 1 In vitro neoangiogenesis in Matrigel in 4 groups of RAECs (×200)

圖2 基因芯片雜交結(jié)果(Agilent G2565B熒光掃描儀)Fig. 2 Hybridized Agilent DNA microarray (part number G2505B)

3 討 論

FIZZ1是由111個氨基酸殘基構(gòu)成的分泌型蛋白，分子量為9.4kD，其結(jié)構(gòu)分為3個區(qū)域：N端信號序列、不固定的中間部分、高度保守的半胱氨酸重復基序(1CX l12CX83C X4CX35CXl06CX7CX8CX99C10C)構(gòu)成的獨特的C末端功能區(qū)。FIZZ1的C末端功能區(qū)與Resistin家族其他成員一致，故又被稱為抵抗素樣分子α(resistinlike molecules alpha，RELMα)。FIZZl具有明顯的分布特異性，主要位于肺泡上皮細胞、白色脂肪組織、心臟，在外周血單核細胞、活化的巨噬細胞及動脈粥樣硬化斑塊中也有顯著表達[6]。

表1 FIZZ1刺激后RAECs中活性上調(diào)的部分信號通路Tab. 1 Pathway up-regulation of RAECs after FIZZ1 stimulation

表2 FIZZ1刺激后RAECs中活性下調(diào)的部分信號通路Tab. 2 Pathway down-regulation of RAECs after FIZZ1 stimulation

目前研究結(jié)果表明，F(xiàn)IZZ1具有刺激肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移，收縮血管，刺激肌纖維母細胞分化等功能[3-4]，在肺纖維化、哮喘、缺氧、矽肺等疾病的致病機制中具有重要意義，但其是否能促進內(nèi)皮細胞血管新生目前國內(nèi)外均未見報道。Tong等[5]研究表明，F(xiàn)IZZ1具有刺激內(nèi)皮細胞分泌血管細胞黏附分子1(VCAM-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的功能，其中VEGF能明顯刺激血管新生，F(xiàn)IZZ1通過PI3K-AKt-NF-κB信號通路可進一步誘導VEGF表達[7]。然而Teng等[4]已證實PI3K的抑制劑LY294002僅能部分抑制FIZZ1引起的肺血管平滑肌細胞增殖、遷移，提示PI3K/Akt并非FIZZ1刺激血管平滑肌細胞增殖、遷移的唯一通路。Yamaji-Kegan等[8]的研究表明，F(xiàn)IZZ1能促進肺微血管內(nèi)皮細胞血管新生，抗VEGF抗體僅能部分抑制血管新生，提示FIZZ1刺激血管新生可能依賴于多種途徑。上述研究提示FIZZ1可促進主動脈內(nèi)皮細胞血管新生，且機制復雜多樣。

本研究結(jié)果顯示FIZZ1對RAECs血管新生管腔形成具有明顯的促進作用，且在5×10–9～2×10–8mol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性地增加新生血管管腔形成的數(shù)目，說明FIZZ1可明顯促進RAECs新生血管的形成。既往研究表明，F(xiàn)IZZ1在鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)呈陽性表達，粥樣斑塊內(nèi)的血管新生可促進斑塊進展及其并發(fā)癥的發(fā)生，動脈粥樣硬化的早期即有內(nèi)膜新生血管形成，斑塊內(nèi)高通透性的新生血管是產(chǎn)生脂蛋白的主要來源，導致大纖維帽覆蓋下的斑塊不斷聚集，且斑塊內(nèi)新生血管管壁發(fā)育不完善，易導致斑塊出現(xiàn)裂隙、破裂，隨之出現(xiàn)血小板黏附、聚集和血栓形成[7]。以上問題與斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂、不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死和心源性猝死的發(fā)生高度相關(guān)[9]。

為進一步探討FIZZ1刺激血管新生的機制，本實驗運用大鼠全基因表達譜基因芯片雜交技術(shù)分析FIZZ1刺激后信號通路的表達變化，結(jié)果顯示與對照組比較差異明顯。GeneSpring GX軟件分析結(jié)果顯示，其中12條信號通路活性上調(diào)，如調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架途徑[Regulation of actin cytoskeleton pathway (rno04810)]、縫隙連接信號通路[Gap junction pathway(04540)]等。其中調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架途徑(rno04810)的活性上調(diào)與對照組差異最為明顯，提示該途徑的活化可能參與了FIZZ1刺激內(nèi)皮細胞血管新生。細胞肌動蛋白骨架途徑是使細胞發(fā)生運動遷移的重要組成部分，在細胞突破基底膜建立新生血管腔時，細胞骨架構(gòu)象的變化不可或缺[10]。正因為FIZZ1激活RAECs的肌動蛋白骨架途徑，才使其運動遷移能力增強，更容易突破基底膜形成新生血管?？p隙連接則是存在于相鄰細胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，由細胞膜上的連接子相互銜接而成，每個連接子由6個相同的蛋白亞單位(Cx)組成，主要參與細胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳遞的電偶聯(lián)，對細胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過程具有重要意義。Cx家族中的Cx43表達上調(diào)，數(shù)量增加，可促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，造成內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的遷移[11]。所以FIZZ1還可能通過細胞縫隙連接途徑的活化促進RAECs血管新生。

綜上所述，本研究探討了FIZZ1刺激RAECs后促進其血管新生的能力及其機制，發(fā)現(xiàn)除P13K/Akt通路外，F(xiàn)IZZ1還可能通過細胞肌動蛋白骨架途徑促進RAECs的血管新生。關(guān)于FIZZ1刺激RAECs后細胞肌動蛋白骨架途徑活化促進血管新生的具體信號轉(zhuǎn)導通路仍有待進一步研究闡明。

[1]Holcomb IN, Kabakof RC, Chan B, et al. FIZZ1, a novel cysteine rich secreted protein associated with pulmonary inflammation,defines a new gene family[J]. EMBO J, 2000, 19(15): 4046-4055.

[2]Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation in atherosclerosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32(9):2045-2051.

[3]Steppan CM, Brown EJ, Wright CM, et al. A family of tissuespecific resistin-like molecules[J]. Eur J Endocrinol, 2005,153(2): 217-221.

[4]Teng X, Li D, Champion HC, et al. FIZZ1/RELMalpha, a novel hypoxia-induced mitogenic factorin lung with vasoconstrictive and angiogenic properties[J]. Circ Res, 2003, 92(10): 1065-1067.

[5]Tong Q, Zheng L, Lin L, et al. Hypoxia inducedmitogenic factor promotes vascular adhesion molecule-1 expression via the PI3K/Akt-NF-kappaB signaling pathway[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2006, 35(4): 444-456.

[6]Zhang HM, He ZY. The expression of FIZZ1 in atherosclerotic plaque of ApoE-/-mouse[J]. Chin J Hypertension, 2007, 15(5),392-395. [張紅明, 何作云. FIZZ1在ApoE基因敲除鼠動脈粥樣斑塊中的表達[J]. 中華高血壓雜志, 2007, 15(5), 392-395.]

[7]Pandya NM, Dhalla NS, Santani DD, et al. Angiogenesis--a new target for future therapy[J]. Vascul Pharmacol, 2006, 44(5):265-274.

[8]Yamaji-Kegan K, Su Q, Angelini DJ, et al. Hypoxia-induced mitogenic factor has proangiogenic and proinflammatory effects in the lung via VEGF and VEGF receptor-2[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006, 291(6): L1159-L1168.

[9]Tang YL, Yang YZ. Advances in research of angiogenesis in atherosclerosis plaque[J]. Adv Cardiovasc Dis, 2004, 25(Suppl 1): 1-5. [唐雅玲, 楊永宗. 動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生的研究進展[J]. 心血管病學進展, 2004, 25(Z1): 1-5.]

[10]Kanaan Z, Qadan M, Eichenberger MR, et al. The actincytoskeleton pathway and its potential role in inflammatory bowel disease-associated human colorectal cancer[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2010, 14(3): 347-353.

[11]Wen CL, Liu CH, Wang AC. Research progress in connexin protein family and coronary heart disease and restenosis after coronary stenting[J]. Int J Geriatr, 2012, 33(2): 74-81. [溫朝玲,劉春紅, 王安才. 縫隙連接蛋白家族與冠心病及冠狀動脈內(nèi)支架術(shù)后再狹窄的研究進展[J]. 國際老年醫(yī)學雜志, 2012,33(2): 74-81.]