張巍， 趙行宇，李妍，徐俊杰，姜艷霞，呂士杰

核桃楸是具有治療作用的稀有樹木類物種之一，在亞洲和歐洲，其葉、根及種子是治療癌癥的傳統(tǒng)藥物[1]。胡桃醌(juglone)又名5-羥基-1, 4-萘醌，是一種天然環(huán)狀醌類，可從胡桃楸的葉及外殼中提取。研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌在體外具有抗多種腫瘤細胞(包括人結(jié)腸癌細胞和人淋巴瘤細胞)的活性[2-3]。本研究對不同濃度胡桃醌在人宮頸癌HeLa細胞系的生長和誘導(dǎo)細胞凋亡中的作用進行觀察，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胡桃醌、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)購自Sigma公司，Caspase-3分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 人宮頸癌HeLa細胞系由本院實驗室保存。細胞置于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞單層貼壁生長，每2d更換1次培養(yǎng)基，每周按1:3傳代。于倒置顯微鏡(日本Olympus)下觀察不同濃度胡桃醌對HeLa細胞生長速度、細胞形態(tài)以及懸浮細胞比例的影響。

1.3 MTT法檢測細胞增殖情況 取對數(shù)生長期HeLa細胞，培養(yǎng)24h后，去上清，將細胞分成正常對照組及10、20、50、100、200μmol/L濃度實驗組。各組均采用DMEM培養(yǎng)基稀釋液培養(yǎng)24h，加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4h，棄上清，加入150μl DMSO振蕩10min，于570nm處測定吸光度(A)值。

1.4 流式細胞儀檢測細胞生長周期 取對數(shù)生長期HeLa細胞，培養(yǎng)24h后去上清，分別加入10、20、50、100、200μmol/L胡桃醌，采用DMEM培養(yǎng)基稀釋液分別培養(yǎng)24h后，與空白對照組一起進行胰酶消化，PBS洗滌細胞2次，15 000r/min離心10min(離心半徑10cm)，棄上清，4℃ 70%乙醇沉淀，PI避光染色30min，COUTLER流式細胞儀檢測，Listmode 2.0軟件分析細胞周期分布。

1.5 細胞Caspase-3活性檢測 各組取50μl含100～200μg蛋白的細胞或組織，采用細胞裂解液裂解，取上清加入50μl 2×Reaction Buffer，再加入5μl Caspase-3底物，37℃避光孵育4h。采用酶標(biāo)儀或分光光度計于405nm或400nm波長處測定其吸光度(A)值。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度胡桃醌對HeLa細胞形態(tài)學(xué)的影響不同濃度胡桃醌對HeLa細胞形態(tài)學(xué)的影響見圖1。對照組細胞緊貼瓶底，生長密集，細胞間連接緊密，呈有規(guī)則的多邊形，細胞觸角較短，圓形細胞少。經(jīng)10、20、50、100、200μmol/L濃度胡桃醌處理后，細胞附壁疏松，脫壁，形態(tài)變圓，且上述改變隨濃度增加更明顯。

圖1 不同濃度胡桃醌對HeLa細胞形態(tài)學(xué)的影響(×400)Fig.1 Effect of different concentrations of juglone on HeLa cell morphology (×400)

2.2 胡桃醌對HeLa細胞增殖的影響 不同濃度胡桃醌作用于HeLa細胞后，細胞生長受到不同程度抑制，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，且該抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，隨著藥物濃度增加，抑制率升高(圖2)。

2.3 不同濃度胡桃醌對HeLa細胞周期的影響 正常生長的HeLa細胞G2/M期比例為7.50%。經(jīng)10、20、50、100、200μmol/L胡桃醌處理24h后，G2/M期細胞比例分別增加至12.92%、16.23%、23.64%、34.22%、52.64%(圖3)。

圖2 不同濃度胡桃醌對HeLa細胞增殖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of juglone on Hela cell proliferation

圖3 不同濃度胡桃醌對HeLa細胞周期的影響Fig.3 Effect of different concentrations of juglone on HeLa cell cycle

2.4 不同濃度胡桃醌對HeLa細胞Capase-3活性的影響 不同濃度胡桃醌作用HeLa細胞24h后，Caspase-3活性顯著增加，且存在劑量依賴關(guān)系(圖4)。

圖4 不同濃度胡桃醌對HeLa細胞Caspase-3活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of juglone on the activity of Caspase-3

3 討 論

Pin1與腫瘤細胞的分化和增殖有關(guān)，是腫瘤細胞中高表達的基因之一[4-5]。胡桃醌的抗腫瘤作用在國內(nèi)外均有報道，Chao等[6]及Paulsen等[7]認為其能與Pin1催化域發(fā)生不可逆結(jié)合，從而抑制Pin1的活性。

Caspase家族在細胞凋亡過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。正常情況下Caspase-3以酶原(32kD)形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17kD)和兩個小亞基(12kD)組成，裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。在細胞凋亡晚期及死亡細胞中，Caspase-3活性明顯下降[8-11]。

本研究形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度的胡桃醌均能使HeLa細胞形態(tài)發(fā)生變化，且MTT檢測顯示，不同濃度的胡桃醌均可明顯抑制HeLa細胞的增殖。進一步對其凋亡情況進行檢測，結(jié)果顯示不同濃度胡桃醌均可將HeLa細胞周期阻滯于G2/M期，而Caspase-3活性檢測顯示胡桃醌可使Caspase-3活性增加，且具有劑量依賴性。

總之，本研究結(jié)果顯示，胡桃醌能誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡，有望成為繼傳統(tǒng)化療藥物之后的又一新型化療藥物，為抗腫瘤治療提供新的途徑。

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