楊力，郭南京，蔡德鴻，程彥臻，張振，張樺

2007－2008年全國流行病學(xué)調(diào)查顯示，目前我國糖尿病前期人群已達總?cè)丝诘?5.5%[1]，如不及時干預(yù)，約有50%最終會發(fā)展為糖尿病。胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是腸道L細胞分泌的重要腸肽激素[2]，具有葡萄糖依賴性的促胰島素分泌作用[3-4]，在糖尿病領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但在糖尿病前期方面的作用尚未明確。近期的體外研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1可抑制糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)及炎癥因子所致的氧化應(yīng)激作用，防止細胞凋亡[5]。為進一步了解GLP-1的作用，拓展其應(yīng)用，本研究采用不同濃度GLP-1受體激動劑——利拉魯肽(liraglutide)對自發(fā)性糖耐量異常動物模型雄性O(shè)LETF (Otsuka-Long-Evans-Tokushima Fatty)大鼠及同種系LETO(Long-Evans-Tokushima-Otsuka)大鼠進行干預(yù)，檢測血清中血糖、胰島素、主要的AGEs及炎癥因子水平，觀察利拉魯肽干預(yù)對糖尿病前期OLETF大鼠糖代謝的影響，并探討其相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性4周齡OLETF大鼠32只，同周齡雄性LETO大鼠8只為其同種系正常對照，均由日本大冢制藥株式會社德島研究所贈送。每籠4～6只飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，環(huán)境溫度控制在21±2℃，濕度為55%±10%，光照與黑暗12h交替。標準飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水。12周齡時進行糖耐量試驗(隔夜禁食12h，葡萄糖2g/kg胃管注入)，檢測0、30、60、90、120min時血糖，參照日本大冢制藥株式會社德島研究所關(guān)于OLETF大鼠的實驗研究[6]，血糖峰值＞16.7mmol/L且2h血糖＞11.1mmol/L診斷為糖尿病，符合任何一項診斷為糖耐量異常(impaired glucose tolerance，IGT)。將符合IGT診斷的OLETF大鼠(IGT-OLETF)隨機分成4組，每組8只，單籠飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑及配制：利拉魯肽(丹麥諾和諾德制藥公司)，采用1ml注射器分次抽取利拉魯肽注射筆(3ml/支，6mg/ml)筆芯注射液，加入4℃ 0.9% NaCl，分別配成200、100、50μg/ml 3種濃度的利拉魯肽溶液，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝，放置于4℃保存?zhèn)溆谩GEs、胰島素、血清超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒均購自武漢伊艾博科技有限公司。主要儀器：酶標檢測儀器(美國Bio-Rad公司)，穩(wěn)豪?倍優(yōu)型血糖儀[強生(中國)醫(yī)療器材有限公司]，－80℃超低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 實驗分組 將8只LETO大鼠作為LETO-saline(正常對照)組，給予生理鹽水0.5ml/kg，2次/d。另外將造模成功的IGT-OLETF大鼠隨機分為4組(每組8只)：①OLETF-saline組(給予生理鹽水0.5ml/kg，2次/d[7])；②OLETF/LR-50μg/kg組(給予利拉魯肽50μg/kg，2次/d)；③OLETF/LR-100μg/kg組(給予利拉魯肽100μg/kg，2次/d)；④OLETF/LR-200μg/kg組(給予利拉魯肽200μg/kg，2次/d)。由于實驗灌胃失誤，導(dǎo)致OLETF/LR-100μg/kg組和OLETF/LR-200μg/kg組各死亡1只。以上藥物均為每日早7：30和晚7：30各注射1次，腹腔注射，持續(xù)12周后處死實驗動物。

1.4 一般項目觀察 實驗期間每周記錄各組實驗動物體重和進食量。分別于干預(yù)后每周行OGヰ 測定。取鼠尾靜脈血進行空腹和服糖后2h血糖測定。于0和12周尾靜脈采血，分離血清，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血清指標檢測 檢測大鼠均于末次干預(yù)給藥后次日上午，腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉(此前禁食15h)，右心室徹底放血處死大鼠，收集血液離心后－80℃保存。采用ELISA法檢測血清AGEs、空腹胰島素(FIns)、Hs-CRP、TNF-α和IL-6水平。根據(jù)公式計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMAIR=FBG×FIns/22.5)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以表示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)多組間比較采用重復(fù)測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較方差齊性采用Bonferroni法，方差不齊采用Dunnet's T3法檢驗，干預(yù)前后數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般項目 干預(yù)前各組IGT-OLETF大鼠進食量及體重較LETO大鼠增多(P＜0.0001)。利拉魯肽干預(yù)1周后，不同劑量干預(yù)組IGT-OLETF大鼠體重及進食量均較干預(yù)前有所減少，體重較OLETF-saline組大鼠也有所降低(P＜0.05)。干預(yù)后第2周開始，各組大鼠進食量及體重均逐漸增加，不同劑量利拉魯肽干預(yù)組的體重均較LETO-saline組明顯增加(P＜0.01)，與OLETF-saline大鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

2.2 血清糖代謝指標的比較 干預(yù)前OLETF大鼠空腹血糖(FPG)、糖耐量后2h血糖(2hPG)、空腹胰島素均高于LETO大鼠，提示胰島素抵抗導(dǎo)致血糖升高。50、100、200μg/kg利拉魯肽干預(yù)2周后，OLETF大鼠的FPG、2hPG、空腹胰島素均低于生理鹽水干預(yù)組(P＜0.05)，之后血糖一直維持在與LETO大鼠相似的水平，不同劑量組間FPG、2hPG及空腹胰島素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。干預(yù)實驗結(jié)束后，生理鹽水干預(yù)組8只OLETF大鼠中有7只(87.5%)發(fā)展成了糖尿病，利拉魯肽干預(yù)組22只大鼠均未發(fā)生糖尿病(圖2、表1)。

圖1 干預(yù)處理后大鼠進食量(A)和體重(B)的變化Fig. 1 Changes of food intake (A) and weight (B) after intervention LR. Liraglutide

2.3 各組大鼠AGEs、炎癥指標的變化 干預(yù)前OLETF大鼠AGEs與TNF-α、IL-6水平均高于LETO大鼠(P＜0.05)。給予不同劑量利拉魯肽干預(yù)12周后，OLETF大鼠AGEs、TNF-α、IL-6水平均降低(P＜0.01)，其中OLETF/LR-200μg/kg 組AGEs較50μg/kg組下降更明顯(P＜0.05，表2)，表明利拉魯肽降低AGEs呈劑量依賴性。

圖2 利拉魯肽干預(yù)對空腹血糖(A)、糖耐量2h血糖(B)的影響Fig. 2 Change of fasting blood glucose and 2h post-prandial blood glucose after intervention with liraglutide LR. Liraglutide

表1 血清胰島素比較(x±s)Tab. 1 Fasting insulin before and after intervention (x±s)

3 討 論

OLETF大鼠是日本大冢制藥公司經(jīng)20代的傳代篩選開發(fā)的一種自發(fā)性2型糖尿病大鼠，該鼠由于膽囊收縮素(CCK)-A受體基因表達缺失而導(dǎo)致食欲亢進和肥胖。此鼠貪食，不好運動，體形肥胖，逐漸出現(xiàn)糖尿病，與人類2型糖尿病的病理生理進程極為相似，是目前國際上公認的最佳自發(fā)性2型糖尿病模型之一[8]，而23周齡前的OLETF大鼠則是研究糖尿病前期病理生理機制及干預(yù)治療措施的理想動物模型[9]。

表2 利拉魯肽干預(yù)后血清AGEs及炎癥因子的比較(Tab. 2 Serum AGEs and markers of inflammation after intervention with liraglutide (

表2 利拉魯肽干預(yù)后血清AGEs及炎癥因子的比較(Tab. 2 Serum AGEs and markers of inflammation after intervention with liraglutide (

(1)P＜0.05 compared with LETO-saline group; (2)P＜0.05 compared with OLETF-saline group; (3)P＜0.05 compared with OLETF/LR-50μg/kg group

Group n AGEs (ng/ml) TNF-α (ng/ml) Hs-CRP (ng/ml) IL-6 (pg/ml)LETO-saline 8 1.275±0.191 34.55±3.62 4.22±0.35 4.73±0.38 OLETF-saline 8 1.755±0.094(1) 53.22±2.09(1) 5.72±0.18 8.72±0.19(1)OLETF/LR-50μg/kg 8 1.564±0.140(1)(2) 35.47±3.29(2) 4.14±0.17 5.63±0.32(2)OLETF/LR-100μg/kg 7 1.392±0.128(2) 33.57±6.29(2) 3.90±0.48(2) 4.79±0.90(2)OLETF/LR-200μg/kg 7 1.351±0.153(2)(3) 34.72±5.06(2) 3.68±0.12(2) 5.11±0.26(2)

GLP-1是腸道細胞分泌的一種促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的重要激素，其受體激動劑——利拉魯肽具有減輕體重，直接刺激胰島β細胞增殖、誘導(dǎo)細胞再生、阻止胰島細胞凋亡的作用，故而廣泛用于2型糖尿病的治療。但GLP-1對2型糖尿病前期的作用尚不明確，因此在本研究中我們采用IGT-OLETF大鼠模型作為研究對象，使用不同劑量利拉魯肽進行干預(yù)，結(jié)果顯示利拉魯肽不僅可以改善OLETF大鼠的胰島素抵抗狀態(tài)及糖耐量異常，同時能夠明顯降低血清中AGEs和炎癥標志物(如Hs-CRP、TNF-α、IL-6)的水平。

近年來多項研究揭示，糖耐量異常階段人群血清AGEs及多種炎癥因子均較健康人明顯升高[10]，說明非酶糖化及炎癥反應(yīng)在糖尿病前期階段即已存在，它們造成的氧化應(yīng)激作用可能加重胰島β細胞損害及胰島素抵抗，在糖尿病前期向糖尿病轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要推動作用，進行有效的早期干預(yù)可延緩2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。

最新的體外研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1在多種細胞中均可抑制AGEs-RAGE-氧化應(yīng)激軸，防止細胞凋亡。Ishibashi等[5]報道在腎小球系膜細胞中GLP-1可下調(diào)RAGE表達，從而拮抗AGEs的作用，減少ROS的形成。此后Puddu等[11]在胰腺β細胞HIT-T 15中也發(fā)現(xiàn)GLP-1可抑制AGEs誘導(dǎo)的RAGE表達，抵抗AGEs誘導(dǎo)的細胞凋亡和壞死。在我們的研究中，利拉魯肽可降低自發(fā)糖耐量異常動物模型血清中AGEs和炎癥標志物的水平。因此，我們推測，利拉魯肽在糖尿病前期階段可能通過抑制非酶糖化及抗炎作用，改善胰島素抵抗及胰島細胞功能，從而達到延緩糖尿病進展的目的。

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