戚麗華，張傳福，史云，胡曉豐，宋宏彬，劉雪林

軍事醫(yī)學科學院 疾病預防控制所，北京 100071

SmartAmp(smart amplification process)技術是日本學者Mitani等于2007年首先報道的一種新的DNA等溫擴增技術。根據目標序列設計5條引物，在Aac DNA聚合酶的作用下實現自循環(huán)鏈置換反應，并通過引物上結合的雜交敏感的熒光染料實現對擴增過程的監(jiān)測[1]。和其他檢測方法相比，Smart?Amp技術具有快速、精確、靈敏、特異、背景低、成本低等優(yōu)點[2]，目前在基因多態(tài)性分析、感染性疾病診斷，以及食品、環(huán)境中病原體快速檢測等方面已有初步應用，并顯示了很好的應用前景。

1 SmartAmp技術原理

SmartAmp技術的基本原理，即獲取目標序列后在等溫條件下對其反復進行擴增，并通過熒光實時監(jiān)測，以檢測目標序列的存在。根據目標序列保守區(qū)域設計 turnback primer(TP)、forward primer(FP)、boost primer(BP)、outer primer 1(OP1)、outer primer 2(OP2)等共5條引物[3]。TP由退火序列和一段能夠與目標序列互補的核苷酸序列構成，FP帶有一個莖環(huán)結構，它們的退火位點分別位于目標序列的兩端，可分別從兩端與互補的2條DNA單鏈退火，向對側延伸。OP1和OP2的退火位點分別位于TP和FP外側，向中間退火延伸的同時將TP和FP延伸得到的雙鏈剝離。帶有TP或FP的單鏈被置換下來后又可作為模板，繼續(xù)上述過程，如此可形成2種關鍵的單鏈中間產物，這2種中間產物繼而分別以TP和FP的特殊結構為起點，進行自身引導的DNA合成。這樣循環(huán)往復，在Aac DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應，實現目標序列的大量擴增[4]。在此過程中，其中一條引物上結合一種雜交敏感的熒光引物，一旦與互補序列退火雜交，即可發(fā)出一定強度的熒光，由實時熒光定量PCR儀監(jiān)測。隨著擴增反應的進行，熒光強度增大，當超過檢測最低閾值時即可確定擴增反應的實現，也即目標序列的存在[1]。整個過程在60℃恒溫條件下30～40 min即可完成[3]。

2 SmartAmp技術的優(yōu)點

SmartAmp技術具有獨特的錯配抑制技術，能夠識別單個核苷酸的差異。首先，反應使用了5條不對稱引物，當DNA鏈與任何一條引物不匹配時，就會阻止后續(xù)的擴增反應。另外反應體系中還加入了錯配結合蛋白Taq MutS，如果引物出現單個堿基的錯配，Taq MutS即結合到錯配區(qū)域，使擴增反應停止[5]，不再有熒光產生。SmartAmp的這一特點使得它能夠檢測出單個核苷酸的差異，從而成為單核苷酸多態(tài)性檢測的有力方法。這也是與其他等溫擴增技術，如環(huán)介導恒溫擴增、鏈置換擴增、核酸序列擴增、轉錄酶擴增、滾環(huán)擴增、解鏈酶擴增等相比，SmartAmp最為明顯的優(yōu)點。在病原微生物的檢測方面，SmartAmp也能夠降低其他污染的影響。

SmartAmp技術不需要核酸純化，在檢測過程中使用的Aac DNA聚合酶具有很強的抑制細胞污染物影響的能力，只需要一個簡單的熱處理使DNA和蛋白質變性(如血樣，98℃ 3 min)，即可直接分析臨床樣品。而PCR所用的Taq DNA聚合酶，極易因樣品不純而受到抑制，必須進行DNA純化[1]。2009年，Victor等還提出使用一種SmartAmp等溫裂解緩沖液(SmartAmp isothermal lysis buffer，SIL-B)，它能夠在60℃下溶解血細胞，使DNA變性，這樣就可以實現完全的等溫擴增[6]。

SmartAmp技術具有較低的背景。在其等溫擴增過程中使用的雜交敏感的熒光引物，相當于一種序列特異性染料，一旦與互補序列雜交，引物上的熒光即向實時PCR儀提供信號[1]。它在低背景下顯示了很高的信號強度，大大提高了反應的信噪比。檢測的特異性和靈敏度也隨之增強[7]。

SmartAmp技術與傳統的檢測基因多態(tài)性的方法，如DNA芯片、限制性片段長度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)、等位基因特異性多 PCR(AS-PCR)、Se?quenom、TaqMan探針、Invader等相比，具有簡單、快速、成本低、靈敏度高等明顯優(yōu)勢。它的出現，使得臨床上檢測基因多態(tài)性，而后制定個體化治療方案、給出相應生活方式建議這一發(fā)展趨勢更加現實可行[5]，能夠極大地促進現代醫(yī)學的發(fā)展。

SmartAmp同樣可以用來檢測臨床樣本、食物、環(huán)境中的病原體[3,8]。目前常用的病原體檢測方法有培養(yǎng)法、噬菌體法、電化學方法、基因芯片、免疫學方法、PCR及同樣為等溫擴增的LAMP等，與這些方法相比，SmartAmp技術具有快速、簡單、成本低等明顯優(yōu)勢。各種方法的詳細比較見表1。

SmartAmp還可通過一步法對RNA進行擴增，稱為RT-SmartAmp，由Kawai等設計并應用于2009年大流行的甲型流感H1N1病毒的快速檢測中[3]。只需在反應體系中加入禽骨髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶，即可將RNA反轉錄和DNA擴增合為一步。

另外，在臨床上還可以通過一種連接了電荷耦合相機的數字過程進行檢測，使用96孔板或384孔板及自動化分裝單元能夠顯著增加處理量[7]，這樣可極大地提高檢測效率，進一步降低檢測成本。

3 SmartAmp技術的應用

SmartAmp作為一種新的DNA等溫擴增技術，由于其具有簡單、快速、特異性強、靈敏度高[1,3,5]的特點，目前已在感染性疾病診斷、基因快速篩查、個體化用藥等方面得到日益廣泛的應用。

3.1 感染性疾病診斷

SmartAmp技術能夠用于細菌、病毒等病原體的快速檢測。依據其具有識別出單個核苷酸差異的能力，不同型別的菌毒株和耐藥的變異菌毒株也都能同時被快速檢測出來[6]。日本學者Kawai等在2009年將一步法RT-SmartAmp技術運用到當年大流行的甲型流感H1N1病毒的檢測中[3]，并與廣泛使用的流感快速診斷試驗進行了比較，顯示SmartAmp方法在疾病早期即能檢出病毒，可同時區(qū)分2009年甲流毒株H1N1和季節(jié)性H1N1毒株，并且靈敏度高，有較好的特異性，是用于臨床H1N1流感病毒快速檢測的有效手段。

表1 病原體不同檢測方法比較

3.2 快速基因篩查

我們知道肥胖、心臟疾病、慢性炎性疾病等與患者的基因多態(tài)性有關，SmartAmp技術可以分析這些基因標志，臨床的起始材料可以是血樣、口腔拭子或指甲屑等。一旦知道了基因標志，SmartAmp技術就是一種非常簡單、準確度高、成本低的快速基因篩查方法[8]。目前將SmartAmp技術應用到此方面的研究相對較多[19-22]，如2009年Toyoda等用此方法分析發(fā)現了ABCC11基因野生型538G的等位基因538G＞A和耳垢類型、腋臭、肺癌風險有關[19]；2011年，Azuma等利用此方法對人CYP2A6基因進行了分型，這種基因的多態(tài)性被認為是日本男性吸煙者發(fā)生煙草相關肺癌的決定性因素[22]。

3.3 指導個體化用藥

患者的遺傳學特征可決定機體對于藥物和臨床治療的反應。檢測患者疾病相關基因的多態(tài)性，而后據此制定個體化治療方案，是現代醫(yī)學的發(fā)展方向[6]。然而，目前多數檢測技術因為分析速度慢、成本高而在臨床應用上處在瓶頸期。SmartAmp作為一種廉價快速的技術，對此領域起到了極大的推動作用[23-24]。例如，2009年Mitani等用此方法分析了CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G＞A基因的攜帶情況，這3種基因的多態(tài)性對華法林(一種廣泛使用的抗凝血藥)的藥代動力學有重要影響，對它們進行分析有助于指導調整臨床用藥劑量[5]。2010年，Okada等對血樣進行了谷胱甘肽S-轉移酶M1、T1的分型，為臨床上評估與此相關的藥物誘發(fā)肝臟毒性的易感性提供了幫助[25]。又如，ABCC4基因中攜帶2269G＞A等位基因的患者使用含硫代嘌呤藥物容易誘發(fā)造血系統毒性，攜帶此等位基因的患者須相應地減少此類藥物的使用。2011年Aw等用此方法檢測了279名日本患者該等位基因的攜帶情況，指導了臨床用藥[23]。以上這些研究均證實了SmartAmp技術用來分析基因多態(tài)性的有效性。2008年Tatsumi等用SmartAmp技術檢測了原癌基因第12個密碼子的變異，以快速檢測胰腺癌的微小轉移灶，檢測在60 min內完成，據此指導化療，能夠在很大程度上改善預后[26]。

4 SmartAmp技術的發(fā)展前景

SmartAmp作為一種新的DNA等溫擴增技術，自2007年開發(fā)以來，已在個體化治療、快速基因篩查、感染性疾病診斷等領域中顯現出了其實際應用價值，并證明了其具有操作簡便、用時少、成本低、靈敏度高、特異性強、能夠抑制背景影響等優(yōu)勢。而在食物、環(huán)境中病原體檢測方面，雖然尚未見相關研究報道，但SmartAmp方法的原理同樣適用，再加上其獨特的優(yōu)點，使得它在這一領域也呈現出廣闊的應用前景。隨著相應試劑盒的開發(fā)，SmartAmp技術有望成為一種簡易快速的常規(guī)檢測手段，具有廣闊的市場潛力。

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