李彥英 ，王珙 ，李凌瑞 ，周振海 ，李娜 ，毛赟赟 ，李凱 ，王笑非 ，董曉杰

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.上海豐茂生物技術(shù)有限公司，上海 201506

細菌內(nèi)毒素是熱原的一種，來自革蘭陰性菌的外膜。極微量的內(nèi)毒素進入動物或人體內(nèi)都會引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致輕微如發(fā)熱，重則死亡的嚴重后果[1]。各國藥監(jiān)部門對生物產(chǎn)品中的內(nèi)毒素含量均有嚴格規(guī)定。歐洲藥典規(guī)定注射劑內(nèi)毒素限度不得高于5 EU/（kg·h）[2]，EU為內(nèi)毒素單位，每EU內(nèi)毒素約相當于100 pg。

細菌污染的風(fēng)險在生物制藥工藝中廣泛存在。防止細菌污染，控制產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量是廣大生物制藥從業(yè)人員所面臨的巨大挑戰(zhàn)。生物藥物中，單克隆抗體藥物因為使用劑量大（幾十到幾百毫克），對內(nèi)毒素限度的要求因而更高。單克隆抗體作為一類靶向藥物，以其突出的療效和較低的不良反應(yīng)獲得了醫(yī)藥界的極大重視，單抗藥物的研發(fā)也異?；钴S。單克隆抗體作為生物大分子藥物，生產(chǎn)和純化工藝復(fù)雜，有諸多環(huán)節(jié)可能將內(nèi)毒素帶入生產(chǎn)工藝之中。因此，純化工藝步驟中有效去除內(nèi)毒素的能力將為產(chǎn)品符合內(nèi)毒素標準提供保障。

內(nèi)毒素是脂多糖（LPS），其結(jié)構(gòu)包含3個區(qū)域，即類脂A區(qū)、核心多糖區(qū)和特異性多糖區(qū)[3]。其中，核心區(qū)的磷酸化導(dǎo)致內(nèi)毒素在一般蛋白溶液中帶負電荷[4]。內(nèi)毒素的類脂部分為疏水區(qū)，使內(nèi)毒素可以像一些雙極性分子一樣形成微球或微囊結(jié)構(gòu)，將疏水區(qū)包裹在里面。內(nèi)毒素單體的相對分子質(zhì)量為10×103～20×103，其聚合形態(tài)的相對分子質(zhì)量可超過1000×103[5]。

因為內(nèi)毒素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不均一，導(dǎo)致內(nèi)毒素可以多種方式與溶液中的蛋白質(zhì)相互作用，形成復(fù)合物，大大增加了去除的難度[6-7]。在蛋白溶液中去除內(nèi)毒素需要著重考慮所用方法對內(nèi)毒素的特異選擇性，即盡量減小蛋白的損失，又對內(nèi)毒素有較高的親和力。多聚賴氨酸即表現(xiàn)出對內(nèi)毒素有親和作用，以其作為配體的層析介質(zhì)可以選擇性結(jié)合內(nèi)毒素[8]。因為內(nèi)毒素一旦在水溶液中聚集，分子大大增加，膜過濾/超濾法有望通過分子大小的不同將內(nèi)毒素與蛋白分子分離[9]。同樣利用層析原理，精氨酸溶液沖洗已被證明可以將附著在固定相上的單抗分子內(nèi)毒素去除[10]。

我們探討了以上3種方法在單克隆抗體純化過程中去除內(nèi)毒素的應(yīng)用，并分析了它們規(guī)模放大的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

單克隆抗體為中國倉鼠卵巢細胞（CHO）表達的重組蛋白，生產(chǎn)規(guī)模300 L，經(jīng)多步純化，純度高于98%，抗體溶液為檸檬酸緩沖液（pH5.5）。

Pierce填料和試劑盒來自Thermo Fisher公司；2個規(guī)格的納米濾器均來自Millipore公司，Viresolve NFP Opticap 4英寸納米濾器膜面積0.16 m2，Vire?solve Pro Modus濾器膜面積0.22 m2，兩者孔徑均為20 nm，前者配0.1 μm PES膜除菌濾器為預(yù)過濾器，后者用 POD Viresolve Prefilter，面積 0.11 m2；蛋白A填料Mabselect來自GE公司；精氨酸和組氨酸均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 填料法

0.5 mL Spin柱的使用方法參見Thermo Fisher公司的產(chǎn)品說明書。先用0.2 mol/L NaOH/95% 乙醇和 2 mol/L NaCl對柱子再生，用 Tris-Cl（pH7.0）平衡后加入3.5 mL蛋白樣品，室溫搖動1 h，1500 r/min離心收集毒素去除樣品。

1.3 納濾法

納米濾器和預(yù)過濾器使用前先用緩沖液沖洗平衡，再用蠕動泵打入料液?？刂屏魉伲辜{米濾器上游壓力保持在1～2 bar，超過2 bar即為堵塞，不能繼續(xù)使用。

1.4 氨基酸清洗法

蛋白A柱經(jīng)3倍柱體積的Tris緩沖液（pH7.4）平衡后上樣，載量按35 mg/mL計算。此方法來自Rit?zen等的報道[10]并有所改動。蛋白上樣后經(jīng)1倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，即開始氨基酸溶液沖洗，隨后氨基酸被20倍柱體積的平衡緩沖液沖洗去除，單抗即由洗脫液（50 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH3.8）洗脫。其中，精氨酸溶液為0.5 mol/L（pH7.4），組氨酸溶液為0.5 mol/L（pH6.3）。

1.5 單抗和殘留內(nèi)毒素的檢測

單抗?jié)舛葯z測采用紫外吸光度法，按照該單抗吸光系數(shù)計算單抗?jié)舛?。?nèi)毒素檢測參照中國藥典2010年版內(nèi)毒素凝膠限度法進行[11]，鱟試劑檢測限度為0.25 EU/mL。樣品經(jīng)過1/2梯度稀釋，經(jīng)判斷凝膠的形成獲得溶液內(nèi)毒素濃度范圍。本工作中顯示的內(nèi)毒素范圍不同，系樣品稀釋率不同所致。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素去除填料法

Pierce內(nèi)毒素去除填料是一款離子交換介質(zhì)，由多聚賴氨酸共價連接在纖維素基質(zhì)上制成。多聚賴氨酸在填料pH值范圍內(nèi)（pH6～8）帶正電荷，可以與帶負電荷的內(nèi)毒素結(jié)合，并常用于去除內(nèi)毒素的工藝中[8]。

蛋白溶液和填料混合孵育1 h后，用Spin柱收集流穿的蛋白樣品，發(fā)現(xiàn)起始含量為0.8（批次1）～8 EU/mg（批次2），小量單抗溶液中的內(nèi)毒素均去除了70%，而單抗蛋白幾乎沒有損失（表1），與填料說明書中描述的可以達到的內(nèi)毒素最低限度一致。

在進一步用內(nèi)毒素去除填料的實驗中，對填料的使用條件，如靜態(tài)（將填料和蛋白溶液在室溫或4℃孵育4 h，并不斷攪拌，再經(jīng)過沉淀分離蛋白溶液和填料）和動態(tài)結(jié)合、樣品蛋白濃度、溶液pH值、溶液離子強度等分別做了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅溶液pH值調(diào)整為7.4時可使內(nèi)毒素含量進一步下降50%，其他條件的改變均沒有明顯提高內(nèi)毒素去除的程度，未達到預(yù)期結(jié)果。

2.2 納濾法

如表2所示，在第一組實驗中，含有250 EU/mL內(nèi)毒素的蛋白溶液（蛋白濃度33.24 mg/mL）經(jīng)納濾過濾后，內(nèi)毒素含量下降了89%，不弱于使用Pierce內(nèi)毒素去除填料的效果。在過濾過程中，20 nm濾器出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，跨膜壓力差大幅增加，可能是內(nèi)毒素在膜前蓄積造成膜的堵塞。這種現(xiàn)象在內(nèi)毒素含量低的蛋白料液過濾中沒有發(fā)生，因此判斷不是由于單抗分子造成的。第二組實驗在納濾膜包的上游安裝了配套的前濾器，其性質(zhì)是一種帶正電荷的深層濾器，可以攔截顆粒狀物質(zhì)，增加納濾膜包的處理量。在加裝了深層預(yù)過濾器的納濾中，總體內(nèi)毒素去除也達到88%，與沒有預(yù)過濾器的情況一致，但料液處理量大幅增加，由每平方米納濾膜41.6 g蛋白提高到874.8 g，達21倍。

2.3 氨基酸清洗法

Ritzen等報道，將單抗結(jié)合在蛋白A柱上后，可以通過精氨酸溶液沖洗，去除混雜在抗體中的內(nèi)毒素[10]。精氨酸沖洗去除內(nèi)毒素的機理尚不清楚，但其殘基帶正電，可能利用電荷作用將內(nèi)毒素與帶正電荷蛋白質(zhì)分開，達到去除的效果。

蛋白A柱廣泛用于單抗純化，方便進行工藝放大。蛋白A柱結(jié)合精氨酸沖洗的方法分別用26和800 mL等2個規(guī)格進行了去除內(nèi)毒素的研究。在精氨酸作用的同時，也考察了另一帶正電的氨基酸，即組氨酸對內(nèi)毒素去除的作用。

單抗按照35 mg/mL動態(tài)載量結(jié)合在蛋白A柱上，用10個柱體積的0～0.5 mol/L精氨酸溶液梯度沖洗層析柱，并接續(xù)使用6倍柱體積的0.5 mol/L精氨酸溶液沖洗，在20倍柱體積的柱平衡液沖洗充分去除殘留精氨酸之后，將單抗蛋白洗脫。結(jié)果顯示，在0.5 mol/L精氨酸梯度沖洗過程中，精氨酸在150 mmol/L水平即可洗脫大量內(nèi)毒素（50～100 EU/mL）（圖1A）。內(nèi)毒素的洗脫在后續(xù)梯度及6個柱體積的沖洗中一直持續(xù)，并略有降低（最低為2.5～25 EU/mL）。精氨酸溶液之后的柱平衡液（20 mmol/L Tris/100 mmol/L NaCl，pH7.4）沖洗僅能獲得很低的內(nèi)毒素濃度（2.5 EU/mL），可見精氨酸溶液的作用在沖洗過程中持續(xù)存在。最終單抗洗脫液的內(nèi)毒素含量下降至 3～6 EU/mL（0.2～0.3 EU/mg）（表 3），優(yōu)于內(nèi)毒素去除填料和納濾的方法。結(jié)果也提示，若增大精氨酸溶液沖洗的體積，單抗洗脫液中的內(nèi)毒素含量有可能進一步降低。

組氨酸溶液洗脫結(jié)果（圖1B）與精氨酸溶液相似。用10個柱體積的組氨酸溶液的0～0.3 mol/L梯度沖洗，隨后進行10個柱體積的0.5 mol/L沖洗。結(jié)果顯示，0.3 mol/L組氨酸溶液即已將大部分內(nèi)毒素去除，單抗洗脫液的內(nèi)毒素達到3～4.5 EU/mL（0.2～0.3 EU/mg）的最終濃度（表3）。因0.5 mol/L組氨酸在pH7.4時發(fā)生鹽析，本實驗中的組氨酸溶液pH值為6.3。與精氨酸相比，組氨酸相對較低的濃度和相對較小的沖洗體積可取得相似的內(nèi)毒素去除效果。

用5 cm層析柱、800 mL裝柱量的條件下，精氨酸沖洗可以獲得和小規(guī)模實驗一致的結(jié)果，并在4個循環(huán)中表現(xiàn)出很好的重復(fù)性，均有97%的去除效果（表3）。因此可初步認為，用蛋白A柱/氨基酸溶液沖洗的方法可以顯著去除單抗中的內(nèi)毒素，工藝可以有效放大。

表1 Pierce填料去除單抗溶液中的內(nèi)毒素

表3 蛋白A柱結(jié)合氨基酸溶液沖洗去除單抗溶液中的內(nèi)毒素

圖1 氨基酸溶液沖洗連接在蛋白A柱上的單抗

因單抗與蛋白A柱結(jié)合對溶液電導(dǎo)不敏感，使用0.5 mol/L的2種氨基酸溶液均沒有導(dǎo)致單抗與蛋白A柱的脫離，從而保持單抗的高回收率（數(shù)據(jù)未示）。組氨酸和精氨酸作為天然氨基酸，對單抗分子沒有影響，對人體也不存在毒性。相比于其他一些需要添加物的內(nèi)毒素去除方法，添加物如表面活性劑等都會給產(chǎn)品及后續(xù)純化工藝帶來各種問題[6]。

3 討論

Pierce內(nèi)毒素去除填料中的多聚賴氨酸配基在中性pH值條件下帶正電荷，以離子交換的形式與內(nèi)毒素結(jié)合[8]。目標單抗pI為pH8～9，這樣帶正電荷的蛋白質(zhì)在陽離子交換柱中會有與層析介質(zhì)競爭內(nèi)毒素的現(xiàn)象[5]。因此，用單純的離子交換法去除帶正電荷的蛋白質(zhì)溶液中的少量內(nèi)毒素是很困難的[7]。雖然此方法可將內(nèi)毒素含量從一個較高水平大幅降低，但殘留的少量內(nèi)毒素通過和蛋白質(zhì)的相互作用而變得頑固。在本實驗中，堿性的單抗溶液內(nèi)毒素含量降低至5 EU/mL水平之后，便很難進一步降低。

Pierce內(nèi)毒素去除填料可以裝柱進行層析操作，有規(guī)模放大的潛力。但是，為了獲得有效的作用時間，樣品的上樣速度緩慢（重力流穿），這就大大增加了污染的風(fēng)險，導(dǎo)致實際操作性差。

內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)包親水特異性多糖區(qū)和疏水類脂A區(qū)，在水溶液中易形成聚合物[5]。內(nèi)毒素的這種分子復(fù)合體形成雙層膜狀結(jié)構(gòu)，體積和分子都很大，在很多應(yīng)用中可以利用這一特征將其去除，例如超濾法[9]。單抗相對分子質(zhì)量達150×103，一般不認為可以有效地通過分子質(zhì)量的區(qū)分將兩者分開。但是，在本實驗中觀察到，經(jīng)過納濾的單抗溶液內(nèi)毒素含量顯著降低，提示大量的內(nèi)毒素是以超過納濾孔徑20 nm的復(fù)合體形式存在的。

納濾前濾器在去除內(nèi)毒素中的作用不清楚。因其帶電特性，可能通過離子交換實現(xiàn)一定程度的結(jié)合內(nèi)毒素的功能[4]。實驗結(jié)果顯示，在有納濾預(yù)過濾器的情況下，納濾的處理量大幅提高，提示大量內(nèi)毒素可能因為滯留在預(yù)過濾器中，沒有過早地堵塞納濾膜包。納濾膜包價格昂貴，且容易堵塞。鑒于在實驗中觀察到深層濾器可能有巨大的去除內(nèi)毒素的能力，單獨使用深層濾器將溶液中內(nèi)毒素降低將是較好的選擇，值得進一步探討。

納濾膜包和前濾器組合本是單抗純化工藝中去除病毒的裝置。其對蛋白結(jié)合很少，可以保證較高的收率（＞90%）。在本實驗中，6 L單抗溶液在2 h內(nèi)完成過濾，而且對單抗蛋白濃度、溶液pH值和電導(dǎo)等參數(shù)均無超出常規(guī)除病毒過濾工藝的特殊要求，非常適合處理中試或以上規(guī)模的單抗溶液。

納濾雖然可以去除形成聚合體的內(nèi)毒素，但在蛋白溶液中，很多內(nèi)毒素還是以單體形式存在的，并與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，無法通過過濾的方法去除。納濾之后的12.5～25 EU/mL的內(nèi)毒素，還需要采取其他方法進一步去除。

從滿足工藝放大的條件上看，使用柱層析方法去除內(nèi)毒素是最方便的[12]。相比較內(nèi)毒素與固定相結(jié)合的動力學(xué)特征，將單抗結(jié)合在層析柱上而使用不同的流動相洗去內(nèi)毒素似乎更加方便。在用氨基酸溶液沖洗去除內(nèi)毒素的實驗中，測試的2個氨基酸雖然都帶有正電荷，但其去除內(nèi)毒素的原理未必相同。組氨酸作為配體被連接在層析基質(zhì)上，作為除內(nèi)毒素的介質(zhì)早已商業(yè)化[13]。Petsch等認為組氨酸可以結(jié)合內(nèi)毒素需要在pH＜5的條件下，因為組氨酸殘基上的咪唑基團pK=6.0[14]。但是，本實驗中使用的pH6.3的組氨酸溶液可以有效洗脫內(nèi)毒素，而這個條件下組氨酸的咪唑基團并不帶電。有必要在后續(xù)工作中摸索氨基酸洗脫內(nèi)毒素的最佳條件，如組氨酸溶液去除內(nèi)毒素和pH值的關(guān)系，以及組氨酸和精氨酸搭配使用的效果。

比較本實驗中考察的3種方法，內(nèi)毒素去除填料價格高，操作時間長，內(nèi)毒素去除較不徹底；納濾法雖然適合中試水平單抗產(chǎn)品的內(nèi)毒素去除，但仍不能充分降低殘留內(nèi)毒素水平；而氨基酸清洗法可以有效地進行工藝放大，層析操作方便，且可將內(nèi)毒素殘留量降至0.25 EU/mg水平，達到中國藥典的要求。將這一步驟整合入單抗純化工藝中，將有助于對純化產(chǎn)品中的內(nèi)毒素水平進行控制。

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