張紅飛 ，張慧娜 ，李軍鋒 ，于虹 ，代曉朋 ，趙光宇 ，郭彥 ，王凱娟 ，張建營 ，周育森

1.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。我國肝癌的發(fā)病率及死亡率均位于惡性腫瘤的第二位[2]。早期診斷、早期治療對提高肝癌患者的生存質(zhì)量具有十分重要的意義。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）是硫酸類肝素蛋白聚糖家族成員，其相對分子質(zhì)量為60×103～70×103，通過糖基磷脂酰肌醇結(jié)合于細(xì)胞表面[3]。研究表明，GPC3在肝癌細(xì)胞中異常表達(dá)，而在正常肝細(xì)胞和其他非腫瘤肝病細(xì)胞表面未見表達(dá)[4-7]，使得GPC3可能成為新的血清學(xué)指標(biāo)，用于肝癌患者的早期診斷[8]。GPC3除了在肝癌診斷上的應(yīng)用之外，其膜蛋白的性質(zhì)決定了其可以作為免疫治療靶點。Ishiguro等發(fā)現(xiàn)，制備的抗 GPC3 C端（524～563殘基）單克隆抗體可以在體外抑制Huh7細(xì)胞的生長，其輔助殺傷腫瘤活性在于其參與的抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxity，ADCC）作用，裸鼠體內(nèi)移植模型研究發(fā)現(xiàn)，抗GPC3抗體GC33可以抑制HepG2或Huh7移植模型的腫瘤生長，并促進(jìn)化療藥物對腫瘤的殺傷作用，同時能明顯降低表達(dá)GPC3的肝癌鼠血清GPC3和甲胎蛋白（AFP）水平[9-12]。

抗體是否誘導(dǎo)ADCC或補體依賴的細(xì)胞毒性（CDC）殺傷腫瘤活性，主要取決于其識別的表位[9]。為了尋找抗肝腫瘤更為有效的抗體，前期我們制備了7株抗GPC3 C端（編碼359～580殘基）的單克隆抗體[13]，在本研究中，我們檢測了這7株單抗是否通過ADCC殺傷肝腫瘤細(xì)胞，并分析了其識別的表位。

1 材料與方法

1.1 材料

7株抗GPC3 C端單抗由本室制備；HepG2細(xì)胞由本研究室留存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)和BL21（DE3）感受態(tài)、小量質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD18-T、限制性內(nèi)切酶、SolutionⅠ連接酶均購自TaKaRa公司；原核表達(dá)載體 pGEX-4T-1、苯甲基磺酰氟（PMSF）購自 Amer?sham公司；IPTG購自Promega公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司；ELISA用顯色液和終止顯色液購自北京萬泰藥業(yè)有限公司；多功能酶標(biāo)儀購自BioTek公司；West?ern印跡顯色試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司；重組人白細(xì)胞介素2（IL-2）購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 抗GPC3 C端抗體輔助殺傷肝腫瘤細(xì)胞的活性檢測

單克隆抗體的殺傷腫瘤活性檢測使用細(xì)胞增殖法[14]檢測ADCC效應(yīng)，以小鼠脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞為表達(dá)GPC3的肝癌細(xì)胞HepG2。實驗分為ADCC殺傷組、效應(yīng)細(xì)胞非特異殺傷組、抗體非特異毒性對照組和單獨靶細(xì)胞組。其中，ADCC殺傷組體系中包含效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞和單抗（共7個處理，分別用1～7號單抗），效應(yīng)細(xì)胞非特異殺傷組體系中包含效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，抗體非特異毒性對照組包含靶細(xì)胞和單克隆抗體（共7個處理，分別用1～7號單抗），單獨靶細(xì)胞組只包括HepG2靶細(xì)胞。靶細(xì)胞數(shù)目為8000/孔，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為2∶1。另外，每組均加入重組人IL-2 100 U/mL。每組均重復(fù)6次。

上述體系加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，在樣品和空白孔中每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150 μL DMSO混勻溶解后測量D490nm值，以檢測存活的細(xì)胞數(shù)目。以P＜0.05為檢驗水準(zhǔn)，判定ADCC殺傷組與效應(yīng)細(xì)胞非特異殺傷組間D490nm值、抗體非特異毒性對照組與單獨靶細(xì)胞組間D490nm值差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，從而判定不同抗體是否具有輔助殺傷肝腫瘤的活性。

1.3 GPC3 C端蛋白的截短表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank中GPC3已知序列（GenBank登錄號：L47125.1），用生物信息學(xué)分析軟件GoldKey對GPC3 C端進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)及抗原表位分析，預(yù)測其優(yōu)勢表位，并據(jù)此將其分4個片段進(jìn)行截短表達(dá)，分別命名為F1～F4，設(shè)計克隆引物名稱和序列如表1。

以前期構(gòu)建的含GPC3 C端359～580殘基編碼基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴增F1～F4編碼基因，分別連接pMD18-T克隆載體，經(jīng)序列測定后將序列正確的克隆用BamHⅠ和SalⅠ酶切，回收目的片段后分別連接經(jīng)同樣酶切回收的pGEX-4T-1原核表達(dá)載體，氨芐西林抗性選取單克隆菌落，擴增后提取質(zhì)粒，用PCR方法鑒定，擴增片段理論大小分別為213、153、153和195 bp。將經(jīng)PCR鑒定正確的質(zhì)粒交北京奧科鼎盛生物科技公司測序，正確重組的克隆分別命名為pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3CF4。

表1 GPC3 C端截短片段基因克隆引物

1.4 GPC3截短片段重組蛋白的表達(dá)及純化

將構(gòu)建的pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3C-F4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h以表達(dá)蛋白，離心收菌后加入PBS重懸，以4×SDS上樣緩沖液處理樣品，以未誘導(dǎo)細(xì)菌為對照進(jìn)行SDS-PAGE，分析GST-GPC3CF1～GST-GPC3C-F4共4種蛋白的表達(dá)，4種蛋白的理論相對分子質(zhì)量分別約為 34×103、32×103、32×103和33×103。將成功表達(dá)的克隆菌轉(zhuǎn)接250 mL LB培養(yǎng)液，IPTG過夜誘導(dǎo)以大量表達(dá)蛋白，離心收菌后加入超聲緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH7.8）和終濃度為1 mmol/L的PMSF，用超聲波細(xì)胞破碎機以100 W的功率超聲15 min，離心后沉淀以包涵體洗滌液（50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5% Triton-X100）洗滌3次后溶于含8 mol/L尿素的包涵體溶解液中，樣品于-80°C保存。采用已報道的方法[15]切膠回收，浸提純化蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE，觀察4種蛋白的純化結(jié)果。

1.5 間接ELISA法分析抗GPC3 C端單克隆抗體識別的表位

將純化的 GST-GPC3C-F1～GST-GPC3C-F4蛋白定量后分別稀釋至 0.5 μg/mL，100 μL/孔、4℃過夜包被于酶標(biāo)板中，每種蛋白包被一個96孔板。以封閉液（含2%BSA的PBS溶液）封閉后，均以不加抗體作為陰性對照，以7株抗GPC3 C端單抗（以1∶100為起始稀釋度，倍比稀釋12個梯度）為一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000稀釋）為二抗。分別加入一抗和二抗，37℃各溫育1 h后加入顯色液顯色10 min，終止顯色，以多功能酶標(biāo)儀測定D450nm值，觀察各抗體在以不同片段蛋白包被情況下的D450nm值大小及隨抗體濃度下降D450nm值的下降情況，以初步判定其表位結(jié)合情況。

1.6 Western印跡分析抗GPC3 C端單克隆抗體識別的表位

將GST-GPC3 C端全長蛋白及純化的GSTGPC3C-F1～GST-GPC3C-F4蛋 白 進(jìn) 行 7次 SDSPAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移后的膜于封閉液（含5%脫脂牛奶的TBS溶液）中封閉后，分別與7株抗GPC3 C端單抗（1∶500稀釋）和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000稀釋）共孵育，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光劑ECL，在暗室中曝光，顯影，定影，在膠片上獲得相應(yīng)的條帶，觀察各抗體與GST-GPC3 C端全長蛋白及純化后的GST-GPC3C-F1～GST-GPC3CF4蛋白的結(jié)合情況，從而判定其表位結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 抗體輔助殺傷肝腫瘤的活性檢測

依據(jù)上述分組及實驗方法鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，MTT法檢測D490nm值。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，抗體非特異毒性對照組與單獨靶細(xì)胞組間D490nm值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A），說明單獨抗體對肝腫瘤HepG2細(xì)胞無直接殺傷作用；而各株抗體對應(yīng)的ADCC殺傷組與效應(yīng)細(xì)胞非特異殺傷組間D490nm值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1B），表明7株抗體均具有不同程度的輔助殺傷作用，其中以5號單抗的殺傷效果最好。

2.2 GPC3 C端的表位預(yù)測分析及重組表達(dá)

用生物信息學(xué)技術(shù)對GPC3 C端抗原表位進(jìn)行分析，預(yù)測發(fā)現(xiàn)4個優(yōu)勢表位，其相應(yīng)的位置和氨基酸序列見表2。

根據(jù)表位位置，將GPC3 C端截短為4個片段，分別為GPC3C-F1（359～425殘基）、GPC3C-F2（426～472殘基）、GPC3C-F3（473～525殘基）和GPC3C-F4（526～580殘基）。PCR擴增GPC3C-F1～GPC3C-F4編碼基因，分別連接pMD18-T克隆載體，經(jīng)序列測定后依據(jù)上述方法連接到pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中，氨芐西林抗性選取單克隆菌落，擴增后提取質(zhì)粒，用PCR方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2所示，鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)測序后證明與GST正確融合且未發(fā)生序列突變（圖3），提示GPC3 C端4個截短表達(dá)載體構(gòu)建成功。

表2 GPC3 C端蛋白抗原表位預(yù)測分析結(jié)果

圖1 7株抗體的ADCC活性檢測

圖2 pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3C-F4質(zhì)粒的PCR鑒定

圖3 pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3C-F4質(zhì)粒的部分測序結(jié)果

將構(gòu)建的pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3C-F4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組表達(dá)，4種重組蛋白的大小均與理論值一致，且均以包涵體形式表達(dá)；大量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，采用切膠回收浸提的方法純化，將重組蛋白分別命名為GST-GPC3C-F1～GST-GPC3C-F4。參見圖4。

2.3 GPC3 C端單克隆抗體的識別表位分析

2.3.1 ELISA檢測抗GPC3 C端單抗與不同重組截短蛋白的反應(yīng) 將純化的GST-GPC3C-F1～GSTGPC3C-F4蛋白作為抗原，以上述方法對7株抗GPC3 C端單抗進(jìn)行間接ELISA檢測，測量D450nm值，結(jié)果7株單抗體與GST-GPC3C-F1、-F2、-F4蛋白反應(yīng)的D450nm最大值均小于0.2，且隨稀釋度的增加迅速下降到0.05以下（未顯示結(jié)果），而7株單抗與GST-GPC3C-F3蛋白反應(yīng)的D450nm最大值均大于0.3，且D450nm值隨稀釋度的增加而下降得不明顯（圖5），提示7株單抗均與GST-GPC3C-F3蛋白而不與GST-GPC3C-F1、-F2、-F4蛋白反應(yīng)。初步說明GPC3C-F3含有7株單抗特異性識別的表位。

2.3.2 Western印跡分析抗GPC3 C端單抗識別的抗原表位 以Western印跡對7株抗體的識別表位進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果見圖6，7株單抗均特異性結(jié)合GST-GPC3C-F3，與ELISA結(jié)果一致。

上述2項實驗充分說明，7株抗GPC3 C端單克隆抗體所識別的表位區(qū)為GPC3（473～525殘基）的53殘基長度的肽段，而且是線性抗原表位。

圖4 SDS-PAGE檢測GST-GPC3C-F1～GST-GPC3C-F4蛋白的表達(dá)及純化

圖5 間接ELISA法檢測7株單克隆抗體的識別表位（以GST-GPC3C-F3為抗原）

圖6 Western印跡檢測抗GPC3 C端單克隆抗體的表位識別結(jié)果

3 討論

原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌的發(fā)病率及死亡率均位于惡性腫瘤的第二位。早期診斷、早期治療對提高肝癌患者生存質(zhì)量具有十分重要的意義。研究表明，GPC3與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能是新的肝癌早期診斷標(biāo)志物，同時GPC3還被作為肝癌免疫治療靶點進(jìn)行研究。Ishiguro等將GPC3 C端524～563殘基片段免疫小鼠，篩選出產(chǎn)生的抗體與抗原具有高度結(jié)合特性的雜交瘤細(xì)胞克隆，獲得了單克隆抗體GC33，發(fā)現(xiàn)該抗體可以抑制HepG2或Huh7移植小鼠模型的腫瘤生長，促進(jìn)化療藥物對腫瘤的殺傷作用，其作用歸功于ADCC作用，充分說明了抗GPC3抗體可能發(fā)展成為腫瘤治療的一種手段。

為了尋找抗肝腫瘤更為有效，且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗GPC3抗體，我們制備了7株抗單克隆抗體。為了檢測這些抗體是否具有輔助殺傷肝腫瘤細(xì)胞的活性，我們以小鼠脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞、肝癌細(xì)胞HepG2為靶細(xì)胞，對7株單抗的ADCC作用進(jìn)行了初步探索。結(jié)果顯示，制備的7株單抗均具有不同程度的輔助殺傷作用。為了研究上述腫瘤抑制效果差異是否與其識別的蛋白表位不同有關(guān)，我們利用Goldkey軟件分析了GPC3 C端的優(yōu)勢表位分布情況，并根據(jù)表位分析將GPC3 C端編碼基因分為4個截短片段，通過PCR獲得基因片段，經(jīng)序列測定后，分別連接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，在宿主菌中大量表達(dá)和純化了4種蛋白，用間接ELISA和Western印跡檢測了GPC3 C端單克隆抗體的表位識別情況。結(jié)果顯示，7株抗體均特異性結(jié)合含473～525殘基的蛋白片段，是否識別473～525殘基區(qū)域內(nèi)的不同位置還有待于進(jìn)一步研究。總之，經(jīng)初步檢測，我們前期制備的7株抗GPC3 C端單克隆抗體在細(xì)胞水平上均具有抗肝腫瘤活性，而且上述抗體所識別的表位為GPC3 C端的53個殘基片段的線性表位。這些單抗在動物水平上是否具有抗肝腫瘤效果，尚待進(jìn)一步的研究證實。

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