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嗜熱芽孢桿菌噬菌體的分離及特征研究

2013-10-29 09:36晏愛芬余麗林連兵
生物技術(shù)通訊 2013年1期
關(guān)鍵詞:騰沖菌斑噬菌體

晏愛芬,余麗,林連兵

1.保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院,云南 保山 678000;2.昆明理工大學(xué) 生物工程技術(shù)研究中心,云南 昆明 650224

噬菌體是一類寄生在古生菌和真細(xì)菌中的病毒,是體積微小、結(jié)構(gòu)簡單、性質(zhì)特殊的生命形態(tài)。隨著對噬菌體在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中地位的認(rèn)識(shí)不斷加深,高溫噬菌體引起了越來越多科研工作者的關(guān)注,因?yàn)樗鼈儾粌H可以作為一種模式系統(tǒng),用于研究地?zé)釁^(qū)生物的分子生物學(xué)及生物化學(xué)特性,而且還深刻影響著生物地球化學(xué)和生態(tài)系統(tǒng)的進(jìn)化過程,包括遺傳轉(zhuǎn)換、營養(yǎng)循環(huán)、生物種群結(jié)構(gòu)、生物分類、生物進(jìn)化[1]等。對騰沖熱海嗜熱芽孢桿菌噬菌體的研究,不僅可以了解它們在騰沖熱海中的分布及特征,還有助于豐富我國嗜熱噬菌體資源。

本文報(bào)道了分離自騰沖熱海熱泉的一株嗜熱芽孢桿菌噬菌體,我們對其進(jìn)行了電鏡形態(tài)觀察、生理特征初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

噬菌體分離所用的宿主菌嗜熱芽孢桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存;從云南省騰沖縣熱海熱泉采集水樣及沉積物,室溫保存于無菌的離心管中,采樣點(diǎn)溫度為50~75℃,pH值為7.0~8.0。

高溫菌培養(yǎng)基DSM88[2],調(diào)節(jié)pH值為7.5;固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度為2%,半固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度為1%。

1.2 噬菌體的分離及純化

采用雙層平板法分離嗜熱噬菌體[3]。取20 mL熱泉樣品接種到200 mL DSM88液體培養(yǎng)基中,55℃、200 r/min振蕩過夜,所得培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm滅菌濾膜過濾除菌后,取100 μL濾液與350 μL培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期的嗜熱芽孢桿菌混合,室溫靜置10 min后與3 mL半固體培養(yǎng)基混勻,均勻傾倒在DSM88固體平板上,即形成雙層平板;將雙層平板置于密封袋中,55℃培養(yǎng)過夜;肉眼觀察到噬菌斑后,用牙簽挑取單個(gè)噬菌斑,溶于DSM88液體培養(yǎng)基中,作為下次感染的病毒儲(chǔ)液感染宿主細(xì)胞,經(jīng)3次純化獲得純噬菌體。

1.3 噬菌體的形態(tài)觀察

取純化后的噬菌體(效價(jià)為108pfu/mL)10 μL,用一定量的2%醋酸雙氧鈾染色,吸附于230目銅網(wǎng)(噴涂碳膜)上,干燥后用JEOL-TEM1400透射電子顯微鏡觀察。

1.4 最佳感染復(fù)數(shù)的測定

感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)是指初始感染時(shí)加入噬菌體的數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值,也稱感染倍數(shù)。參照Lu等[4]的方法,略有改動(dòng)。培養(yǎng)宿主菌NHH4至對數(shù)前期,用分光光度計(jì)測定此時(shí)的 D600nm值約為 0.2,相當(dāng)于 1×108CFU/mL;按照MOI分別為0.01、0.1、1、10和100的比例,加入噬菌體純培養(yǎng)液和宿主菌,加入DSM88培養(yǎng)基使各管總體積相同;在55℃搖床中160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h,13 000×g離心10 min,收集上清測定噬菌體滴度;各點(diǎn)均作2份復(fù)管培養(yǎng),取平均值,同時(shí)以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體為對照,以產(chǎn)生最高噬菌體滴度的MOI為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.5 物理因素對噬菌體活性的影響

1.5.1 噬菌體的熱穩(wěn)定性分析[5]取滴度為2.1×108pfu/mL的噬菌體懸液1 mL,分別置于50、55、60、65℃水浴鍋中,每隔10 min取一次樣,共取5次,測定各溫度梯度下不同時(shí)間的噬菌體滴度 。

1.5.2 噬菌體pH穩(wěn)定性分析[5]取pH值分別為4、5、6、7、7.5、8、9、10、11的DSM88培養(yǎng)基0.99 mL,加入1.5 mL滅菌離心管中,加入0.01 mL滴度為2.1×108pfu/mL的噬菌體懸液,室溫靜置1 h,用DSM88培養(yǎng)基稀釋至1/10,取20 μL與350 μL對數(shù)期宿主細(xì)胞混合,室溫靜置15 min后測定滴度。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離和純化

把不同采樣點(diǎn)的富集樣品過濾除菌得到的病毒儲(chǔ)液,與培養(yǎng)至對數(shù)期的不同菌株吸附,采用雙層平板法檢測是否有噬菌斑形成。結(jié)果NHH4菌株的菌苔可見清新、透明的噬菌斑,直徑2~4 mm(圖1)。反復(fù)挑取3次純化噬菌體,在合適的液體培養(yǎng)條件下分離到1株噬菌體能快速裂解宿主菌,使培養(yǎng)液變得澄清,噬菌體滴度較高,一般可達(dá)108pfu/mL以上;電鏡觀察,可見形態(tài)均一的噬菌體顆粒。

2.2 噬菌體電鏡形態(tài)

用滅菌牙簽把雙層平板上的噬菌斑挑到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,對噬菌體培養(yǎng)液超速離心濃縮,于電鏡下觀察,噬菌體顆粒為二十面體型,直徑為80~100 nm,無尾,未見刺突,衣殼較薄,截面呈六邊形,邊長60~80 nm(圖2)。根據(jù)其形態(tài),將感染嗜熱芽孢桿菌NHH4的噬菌體命名為嗜熱芽孢桿菌二十面體噬菌體(thermophilicBacillusicosahedral phage,TBIP1)。

2.3 噬菌體TBIP1的最佳MOI測定

加入噬菌體和宿主菌培養(yǎng)8 h后,宿主菌被充分裂解,培養(yǎng)液變得澄清,計(jì)數(shù)各測定管中的噬菌體滴度,結(jié)果見表1。當(dāng)MOI為1、0.1和0.01時(shí),噬菌體TBIP1感染其宿主菌NHH4產(chǎn)生的子代噬菌體的滴度較高;當(dāng)MOI為1.0時(shí),子代噬菌體滴度為1.09×109PFU/mL,在所有MOI中,該產(chǎn)出率最高。因此,確定噬菌體TBIP1感染其宿主嗜熱芽孢桿菌NHH4的最佳MOI為1.0。

圖1 噬菌體在平板上形成的噬菌斑形態(tài)

圖2 二十面體噬菌體TBIP1的形態(tài)

表1 噬菌體TBIP1的感染復(fù)數(shù)測定

2.4 物理因素對噬菌體TBIP1活性的影響

2.4.1 溫度對噬菌體活性的影響 宿主菌NHH4在45~65℃可被TBIP1感染,以培養(yǎng)溫度為55℃時(shí)獲得的噬菌體滴度最高,培養(yǎng)液中噬菌體滴度可達(dá)2.8×108pfu/mL。熱穩(wěn)定性分析(圖3)表明,TBIP1在55℃最穩(wěn)定,隨著溫度升高,其存活率降低,65℃處理20 min后噬菌體失活。

2.4.2 pH值對噬菌體活性的影響 pH值的改變對噬菌體TBIP1滴度的影響較大,從圖4可以看出,在pH為5~9時(shí),噬菌體均保持45%以上的活性,尤以pH7.5時(shí)滴度最高;隨著pH值的升高,噬菌體TBIP1的活性快速降低,pH11時(shí)噬菌體完全失去感染宿主的能力;當(dāng)pH值降到4時(shí)滴度為零。相比之下,TBIP1在較為溫和的pH值環(huán)境下有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

高溫噬菌體生活在一類特殊的環(huán)境中,對溫度具有很強(qiáng)的耐受力和適應(yīng)性,它們通過侵染嗜熱細(xì)菌而生存繁殖,具有獨(dú)特的分子生物學(xué)和生物化學(xué)特性。噬菌體TBIP1是分離自從騰沖熱海溫泉中得到的嗜熱芽孢桿菌NHH4的一株新的烈性噬菌體。TBIP1在DSM88培養(yǎng)基中能夠很好地感染宿主菌NHH4并形成清晰的噬菌斑,感染宿主菌的溫度范圍為45~65℃,最適感染溫度為55℃;感染宿主菌的pH值范圍為5.0~10.0,最適感染pH值為7.5。根據(jù)對噬菌體TBIP1的生物學(xué)特征分析,認(rèn)為噬菌體TBIP1比較典型。

騰沖熱海作為我國著名的火山地?zé)釁^(qū),具有不同水化學(xué)特征的溫泉類型,與之對應(yīng)的漫長的微生物生態(tài)系統(tǒng)的演化,孕育出了現(xiàn)代騰沖熱海豐富的高溫微生物資源。已從騰沖熱海中分離到硫化葉菌噬菌體[6]、棲熱菌噬菌體[5],可見騰沖熱海的嗜熱菌及其噬菌體都具有生物多樣性。騰沖熱海作為我國重要的高溫菌及其嗜熱噬菌體資源寶庫,值得進(jìn)一步研究。

圖3 溫度對噬菌體TBIP1活性的影響

圖4 不同pH值對噬菌體TBIP1活性的影響

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