孫越鵬，耿 磊，李長福，范 芳

(1.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學院，天津 300462;2.天津藥業(yè)研究院有限公司，天津 300000；3.遵義醫(yī)學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

SiRNA沉默HBx表達對HepG 2.2.15細胞增殖和凋亡的影響

孫越鵬1，耿 磊2，李長福3，范 芳3

(1.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學院，天津 300462;2.天津藥業(yè)研究院有限公司，天津 300000；3.遵義醫(yī)學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

目的觀察沉默HB x基因表達對肝癌細胞HepG2.2.15增殖和凋亡的影響。方法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pSIHBV/X轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2.2.15，RT-PCR法檢測HBx mRNA表達；ELISA法檢測細胞上清液中HBsAb和HBeAg的表達情況；MTT法檢測對細胞增殖的影響；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。結(jié)果pSIHBV/X質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞后HBx mRNA表達較對照組明顯降低(P<0.01)；G2.2.15細胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；MTT法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pSIHBV/X質(zhì)粒后HepG2.2.15細胞的增殖受到抑制，AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示HBx siRNA可促進細胞凋亡，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論靶向HBx基因的干擾質(zhì)粒能降低HepG2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg的水平、抑制HepG2.2.15細胞增殖，促進HepG2.2.15細胞凋亡。

RNA干擾；HBx基因；HepG2.2.15細胞；增殖；凋亡

肝細胞癌( hepatocellular carcinoma， HCC) 是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生是一個多階段的病理學過程。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，絕大部分肝癌患者存在過乙型肝炎病毒( heptis B virus，HBV)的感染，HBV是HCC的致病因子已得到公認，HBV x基因編碼的HBV X蛋白與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，可通過反式激活作用干擾宿主細胞的增殖、調(diào)節(jié)細胞周期及凋亡[1-2]。HepG2.2.15細胞是含有HBV基因的肝癌細胞，是研究HBV的細胞模型系統(tǒng)[3]。本實驗應用RNA干擾技術(shù)沉默HBx基因，觀察抑制HBx基因表達對HepG2.2.15細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 肝癌細胞株HepG2.2.15購自博慧斯生物技術(shù)公司；pSIHBV/X與對照質(zhì)粒pTZU+1由瀘州醫(yī)學院張建軍教授惠贈；質(zhì)粒擴增菌種DH5α、內(nèi)切酶等購于寶生物有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國GIBCO產(chǎn)品；胎牛血清購于Hyclone公司；Lipofectamine2000為Invetrogen公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒購自華美生物工程公司；AnnexinV-FITC/PI雙染試劑購自與Sigma公司。

1.2 實驗分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 實驗共分4組：以未轉(zhuǎn)染的細胞作為空白對照組(control group)；僅加脂質(zhì)體的細胞作為脂質(zhì)體組(LipofectamineTM2000 group)；以轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒細胞作為質(zhì)粒對照組(control plasmid group)；以轉(zhuǎn)染pSIHBV/X質(zhì)粒細胞作為pSIHBV/X實驗組(pSIHBV/X group)。利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pTZU+1與pSIHBV/X質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞(操作步驟同說明書)：選取對數(shù)生長期細胞，待細胞融合度為80%時進行轉(zhuǎn)染，6 h后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

1.3 RT-PCR檢測HBx基因的表達 RT-PCR分析轉(zhuǎn)染后24 h各組細胞HBx基因的表達情況，使用HBx引物為：上游5′-TCATCGCCAGCATCATCAAAC-3′，下游3′-ATGTACGGCTGGAGGTCTGTCA-5′，擴增長度為463 bp。用RNA抽提試劑盒分別提取每組細胞總RNA，按試劑盒說明書進行RT反應，以10 μL RT產(chǎn)物為模板，分別擴增β-actin和HBx基因片段。擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，將結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描灰度值，以各組目的基因與內(nèi)參的灰度比值作為相對表達量，比較各組之間的差異。

1.4 ELISA法檢測HBsAb和HBeAg的表達 將pSIHBV/X質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，收集轉(zhuǎn)染前后細胞培養(yǎng)液，采用HBsAb和HBeAg診斷試劑盒及ELISA方法檢測HBsAb和HBeAg的表達情況，計算抑制率。抑制率=(1-實驗孔OD值/空白對照孔OD值)×100%。

1.5 MTT法檢測各組細胞的增殖 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，每孔接種1×104個。培養(yǎng)12 h后，洗掉培養(yǎng)液，換1%胎牛血清的低血清培養(yǎng)基同步化12 h。依實驗分組進行細胞轉(zhuǎn)染，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。時間到后，洗掉培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基100 μL，、50 μLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，酶標儀492 nm波長處測定各孔吸光度值，計算轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后細胞增殖情況。

1.6 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液接種于鋪有蓋玻片的24孔板中，每孔接種2×104個。培養(yǎng)12 h后，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染。取800 μL的Binding Buffer加入8 μL AnnexinV-FITC和8 μL Propidium Iodide(PI)，避光，室溫反應5 min。高倍鏡下隨即取5個視野，在熒光顯微鏡下觀察拍照并計算平均凋亡指數(shù)(凋亡指數(shù) = 每高倍視野凋亡細胞數(shù)/每高倍視野細胞總數(shù)×100 %)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pSIHBV/X酶切、測序

2.1.1 質(zhì)粒pSIHBV/X酶切結(jié)果 pSIHBV/X為氨芐抗性質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α后，對從陽性菌落中擴增提取的質(zhì)粒pSIHBV/X進行酶切，1和2泳道顯示pSIHBV/ X表達載體未被酶切和經(jīng)Sal Ⅰ酶切后，大小基本相等，泳道3顯示經(jīng)Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切后重組體質(zhì)粒產(chǎn)生2800bp、395 bp 左右的兩個條帶，泳道4經(jīng)Xba Ⅰ酶切成約3100bp 的DNA 片段，證實重組表達質(zhì)粒pSIHBV/ X構(gòu)建正確(見圖1)。

注：M:DL5000 marker;1：pSIHBV/X表達載體未被酶切;2: pSIHBV/ X表達載體經(jīng)Sal Ⅰ酶切;3：pSIHBV/ X表達載體經(jīng)Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切;4：pSIHBV/ X表達載體經(jīng)Xba Ⅰ酶切質(zhì)粒pSIHBV/X測序結(jié)果。 圖1 質(zhì)粒pSIHBV/X酶切鑒定

2.1.2 質(zhì)粒pSIHBV/X測序結(jié)果 將質(zhì)粒送到生工測序，引物為U6啟動子的通用引物，測序結(jié)果顯示siRNA的表達模板5′-TCGAGGAACCAACAAGAAGATGAGTTCGCTCATCTTCTTGTTGGTTCT

TTTT-3′成功插入了載體中。證實特異表達載體pSIHBV/X構(gòu)建正確。pSIHBV/X質(zhì)粒插入測序結(jié)果(下劃線為小干擾RNA的作用靶點)：GCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGA

GGAACCAACAAGAAGATGAGTTCGCTCATCTTCT

TGTTGGTTCTTTTTCTAGAGCGGACTTCGGTC.

2.2 RT-PCR檢測HepG2.2.15細胞HBx基因的表達 RT-PCR檢測結(jié)果(見圖2、表1)，pSIHBV/X組HBx表達量低于其它各組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，抑制率為53.6%。而其它各組表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：1：空白對照組 2：脂質(zhì)體組3：空載體組4：pSIHBV/X組。 圖2 HBx基因在HepG2.2.15細胞中24h的表達

表1 HBx在HepG2.2.15細胞中的表達(24 h)

組別HBx/β-actin(x±s)空白對照組1．615±0．148脂質(zhì)體組1．543±0．134pTZU+1空載體組1．669±0．108pSIHBV/X實驗組0．750±0．075??

注：**：與空白對照組比較，P<0.01。

2.3 pSIHBV/對各組細胞中HBsAb和HBeAg的抑制作用 ELISA檢測結(jié)果顯示(見表2，表3)：在轉(zhuǎn)染24 h和48 h后pSIHBV/ X 組細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg 和HBeAg 的表達量都有明顯下降(P<0.01), 空白對照組、脂質(zhì)體組、空載體組差異無顯著性(P>0.05)。

組別OD450(x±s)24h48h空白對照組0．875±0．0791．550±0．185脂質(zhì)體組0．861±0．2241．701±0．076pTZU+1空載體組0．842±0．0271．635±0．145pSIHBV/X實驗組0．466±0．011??0．630±0．877??

注：**：與空白對照組比較，P<0.01。

組別OD450(x±s)24h48h空白對照組0．218±0．1250．365±0．128脂質(zhì)體組0．244±0．0590．447±0．119pTZU+1空載體組0．208±0．0420．341±0．157pSIHBV/X實驗組0．134±0．011??0．217±0．025??

注：**：與空白對照組比較，P<0.01。

2.4 MTT法檢測各組細胞的增殖 MTT法結(jié)果顯示：空白組24 h、48 h、72 h OD490的吸收值分別為0.436±0.027、0.731±0.017、1.105±0.051，而pSIHBV/X組24 h、48 h、72 h OD490的吸收值分別為0.388±0.087*、0.623±0.016*、0.997±0.036*(P<0.05)。從圖3可看出pSIHBV/X組在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h都對細胞生長具有抑制作用，且48 h抑制效果最明顯。

圖3 MTT法檢測各組細胞增殖情況

2.5 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 pSIHBV/X組在24h和48h細胞凋亡數(shù)量明顯高于其它各組，凋亡率分別為25.66%和34.14%(P< 0. 01)。空白對照組、脂質(zhì)體組、pSIHBV/X組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表4)。

表4各組24 h和48 h細胞凋亡指數(shù)

組別總視野數(shù)24h凋亡指數(shù)(x±s)48h凋亡指數(shù)(x±s)空白對照組517．13%±0．19%24．09%±1．22%脂質(zhì)體組519．60%±0．27%25．06%±1．03%pTZU+1空載體組519．32%±4．47%25．65%±0．12%pSIHBV/X實驗組525．66%±1．86%?34．14%±1．05%?

注：*：與空白對照組比較，P<0.05。

3 討論

乙肝病毒的感染是肝臟疾病(包括肝炎，肝硬化和肝癌)發(fā)生的主要原因，[4]。HBV x基因是HBV病毒基因組中最小的開放性讀碼框，是HBV復制的關(guān)鍵性基因，HBx蛋白在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、細胞增殖及凋亡中均具有很強的活性，研究發(fā)現(xiàn) HBx蛋白在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用[5-6]。

HBx基因可通過激活癌基因與細胞因子基因啟動子而調(diào)節(jié)細胞的生長、分化。將HBx基因?qū)胄∈蟪衫w維細胞NIH3T3中，然后用地塞米松誘導，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞DNA合成增加、細胞周期進程加快。研究發(fā)現(xiàn)，HBx基因轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，細胞生長力旺盛、分裂相多見，克隆形成率高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組細胞。對肝癌細胞周期的檢測也發(fā)現(xiàn)，HBx基因轉(zhuǎn)染的HepG2細胞，其G0/G1期細胞比空載體組和未轉(zhuǎn)染組減少而進入S期的細胞比例增高，提示HBx基因轉(zhuǎn)染加快了肝癌細胞周期進程，促進肝癌細胞生長，使肝癌細胞惡性程度增高[7-10]。

HepG2.2.15細胞被廣泛用于HBV病毒的檢測試驗，為了研究pSIHBV/X表達載體能否有效的抑制HBV的復制和表達，進一步的證實抑制效應，本研究檢測了pSIHBV/X對細胞上清液中HBsAg和HBeAg表達的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pSIHBV/X干擾質(zhì)粒于HepG2.2.15細胞沉默HBx基因后HBx mRNA水平表達顯著降低，細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg 和HBeAg 的表達量與對照組相比明顯下降(P<0.01)。pSIHBV/X對HepG2.2.15細胞增殖有明顯抑制作用，抑制率明顯高于空白對照組、空載體組、脂質(zhì)體組(P<0.01)。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最佳，72 h抑制效率下降，其可能原因是siRNA的表達載體隨著細胞的快速分裂而不斷的丟失，從而降低了干擾效率。

目前關(guān)于HBx引發(fā)的凋亡信號通路越來越受到研究者的關(guān)注，但無統(tǒng)一的定論。許多研究已表明，HBX蛋白對細胞的凋亡有著雙層作用。一方面，HBX蛋白可以阻斷凋亡，另一方面卻起著促凋亡作用。HBX蛋白對細胞凋亡的雙層作用顯示了x基因的表達及其在病毒發(fā)病原理中的生理作用是復雜多樣的，而且可能是緊緊相互協(xié)調(diào)的。HBx可通過抑制p53的表達、提高細胞內(nèi)Ca2+濃度、促進survivin的表達等抑制肝癌細胞的凋亡。BcL-2為抑凋亡蛋白，Bax為促凋亡蛋白。研究發(fā)現(xiàn)HBx均能使上述基因高表達，從而證實了HBx既能促進細胞的凋亡又能抑制細胞的凋亡[11-12]。HBx還能通過抑制線粒體膜去極化抑制凋亡[13]。HBx還可以通過氧化應激反應磷酸化Raf-1的ser338/339和Tyr340/341位點，激活Raf-1移位至線粒體使細胞免受應激所引起的凋亡[14-15]。c-myc癌基因既能促進細胞增殖能力又能促進細胞的凋亡能力，c-myc所在HBx瞬時轉(zhuǎn)染的HepG2細胞和HepG2.2.15細胞中表達量相比較，前者要遠遠高于后者[16]。提示了急性感染HBx的HepG2細胞對增殖和凋亡更加敏感。本實驗結(jié)果顯示HBx siRNA對HepG2.2.15細胞的凋亡有促進作用。原因可能是實驗所用肝癌細胞中更多的啟動了凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達。目前為止，HBV感染對肝癌細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用和確切機制尚不清楚，還有待進一步實驗研究。

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[收稿2013-05-02;修回2013-06-10]

(編輯：譚秀榮)

TheeffectsofsilencingofHBxgeneexpressionbysiRNAontheproliferationandapoptosisofHepG2.2.15cells

Sunyuepeng1,Genglei2,Lichangfu3,Fanfang3

(1.Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300462,China;2.Tianjin Pharmaceutical Research Institute Company Limited，Tianjin 300000,China；3.Department of Biochemistry,Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveObserve the effects of silencing HBx gene expression on the proliferation and apoptosis of HepG2.2.15 cells.MethodspSIHBV/X siRNA interference vectors were transfected into HepG2.2.15 cells．The HBx mRNA expression was measured using RT- PCR. The levels of HBsAg and HBeAg in cell supernatant were determined by ELISA. The cell proliferation was evaluated by MTT. The cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining method.ResultsAfter transfection of the pSIHBV/X siRNA vectors，HBx mRNA expression was inhibited compared with control group(P<0.01)；The levels of both HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell supernatants were significantly decreased after the transfection of pSIHBV/X, compared with the control group (P<0.01). The cell proliferation was inhibited and the cell apoptosis was promoted after the transfection of pSIHBV/X, compared with the control group (P<0.01).ConclusionOur results display that HBx gene RNA interference resulted in the reduction of the levels of HBsAg and HBeAg, the inhibition of cell proliferation and the increase of cell apoptosis in HepG2.2.15 cells.

RNA interference; HBx gene; HepG2.2.15；proliferation; apoptosis

R735.7

A

1000-2715(2013)04-0301-05

遵義醫(yī)學院碩士啟動基金資助項目(NO:2004018)。

范芳,女,副教授,碩士生導師,研究方向：腫瘤分子生物學，E-mail:fanf1970@126.com。