趙冠雷，陳學(xué)農(nóng)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 針灸科，貴州 遵義 563099)

電針治療腦癱機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究

趙冠雷，陳學(xué)農(nóng)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 針灸科，貴州 遵義 563099)

目的通過檢測缺氧缺血腦癱模型幼鼠電針治療后腦組織內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的變化，探討電針治療腦癱的作用機(jī)制。方法采用左側(cè)頸總動脈結(jié)扎制備缺氧缺血腦癱模型，按隨機(jī)分組法分為A組假手術(shù)組、B組空白模型、C組針刺治療組和D組電針治療組。治療觀察10d為一療程，療程結(jié)束后斷頭分離腦組織取皮層、海馬、紋狀體，離心后取上清，用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法檢測AChE的含量。結(jié)果針刺、電針均能提高腦癱模型幼鼠腦組織內(nèi)AChE的活性，且電針能顯著提高腦癱模型幼鼠腦組織內(nèi)AChE的活性。假手術(shù)組、電針組與模型組比較幼鼠腦組織內(nèi)的AChE含量明顯升高(P<0.01，P<0.05)，在海馬部位針刺組與模型組比較幼鼠腦組織內(nèi)的AChE含量升高(P<0.05)，在大腦皮層電針組與針刺組比較幼鼠腦組織內(nèi)AChE含量升高(P<0.05)。結(jié)論電針治療后缺氧缺血腦型腦癱幼鼠腦組織內(nèi)AChE的活性明顯升高可能是電針治療腦癱的主要作用機(jī)制。

腦性癱瘓；針刺；電針；乙酰膽堿酯酶(AChE)

小兒腦性癱瘓簡稱腦癱(children，s cerebral palsy，CP)，發(fā)病機(jī)制目前暫不明確，可能為多種綜合因素造成的大腦腦室周圍白質(zhì)非進(jìn)行性損傷，是小兒難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，致殘率為42%～45%。針灸作為傳統(tǒng)特色治療方法，在治療CP方面有著悠久的歷史和豐富的經(jīng)驗(yàn)。而電針作為傳統(tǒng)療法和現(xiàn)代科技發(fā)展的產(chǎn)物，豐富了針灸的治療作用，臨床效果證實(shí)對CP有著很好的治療作用。但國內(nèi)外鮮有電針治療腦癱機(jī)制的研究。我們通過電針對腦癱幼鼠腦組織乙酰膽堿酯酶的影響研究，為電針治療CP提供可能性理論機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，清潔級，許可證號SCXK(渝)2007-0005)遵義醫(yī)學(xué)院解剖實(shí)驗(yàn)室自體繁殖。選用7 d SD 幼鼠67只，飼養(yǎng)環(huán)境：清潔級動物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～25 ℃、相對濕度60%～70%，日光燈照射，定時通風(fēng)，母乳喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 AChE測定試劑盒(R&D公司，10-28-029 )酶標(biāo)儀(BIO-RAD，iMark，美國)。

1.3 模型的建立及分組 根據(jù)參考文獻(xiàn)制作缺氧缺血幼鼠腦癱模型[1]。在異氟醚吸入麻醉后，以75%酒精棉球消毒頸部皮毛，沿正中偏左切開皮膚，仔細(xì)分離左側(cè)迷走神經(jīng)和頸總動脈，并雙重結(jié)扎頸總動脈，術(shù)后縫合切口，待幼鼠恢復(fù)清醒2 h后放入密閉缺氧箱，通入1L/min的8%+92%氮氧混合氣體，2.5 h后取出，整個操作過程保持局部溫度36～37 ℃，造模完成后將幼鼠放回鼠籠，母乳喂養(yǎng)。12 h后進(jìn)行腦癱行為學(xué)評定。李曉捷等[2]的腦癱幼鼠行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)隨意運(yùn)動、姿勢異常、肌張力異常、不自主運(yùn)動、傾斜板實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn)評定造模是否成功?？紤]造模死亡和不成功率較大，在體重大小相近的61只幼鼠隨機(jī)選取10只為A組假手術(shù)組。去除手術(shù)過程死亡及造模不成功9只，將造模成功的42只幼鼠中選取6只及假手術(shù)組選取2只都不行任何干預(yù)，3 d后行HE染色病理切片觀察腦組織變化情況。再將剩余36只隨機(jī)分為BCD組：B組為空白模型組不予任何干預(yù)、C組為針刺治療組給予普通針刺治療和D組為電針治療組給予電針治療，每組12只。

1.4 HE染色病理檢查 將未行任何干預(yù)的2只假手術(shù)組幼鼠及6只缺氧缺血模型幼鼠，3 d后用10%水合氯醛0.4 mL/100g腹腔注射，麻醉后打開腹腔，腹主動脈放血。斷頭取腦，4%的甲醛溶液固定，送遵義醫(yī)學(xué)院病理科檢查幼鼠腦組織受損情況。

1.5 針刺處理 參照李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位，根據(jù)人與動物骨度類比，選取左側(cè)頂顳前斜線，雙側(cè)風(fēng)池透翳風(fēng)、右側(cè)肩髃、外關(guān)、曲尺、合谷、髀關(guān)、伏兔、足三里、解溪。針刺組及電針組在手術(shù)后24 h開始針刺治療。方法：自制鼠架固定，選用0.25 mm×0.25 mm安迪一次性無菌針灸針。頭部穴位沿頭皮呈15 ℃角平刺進(jìn)針刺入約15 mm，進(jìn)針后感覺針下沉緊即可，余穴快速刺入皮下至所需深度，感覺針下有沉緊感后，留針20 min。電針組留針時以G6805-D電針儀用連續(xù)波，5 Hz頻率，強(qiáng)度以局部輕微顫動為度，通電治療20 min；針刺組留針時以平補(bǔ)平瀉手法間隔行針4次，200轉(zhuǎn)/min，每次約2 min。模型組及假手術(shù)組每日抓空，不進(jìn)行任何治療，經(jīng)治療一療程后處死幼鼠取材。

1.6 觀測指標(biāo)測定

1.6.1 取材 10%的水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈放血，快速斷頭，冰盤上操作，取出腦組織，剔除腦膜、血管，冰蒸餾水沖洗，分離腦皮層、海馬、紋狀體，稱重，放入預(yù)冷1∶9的0.5%TrionX-100冰浴勻漿，離心(4 000 r/min，5 min)后取上清，置于80 ℃冰箱待測。

1.6.2 AChE活性測定 按照“AChE測定試劑盒”說明檢測AChE的活性。

2 結(jié)果

2.1 腦組織HE(蘇木精-伊紅)染色光鏡檢查(見圖1、2)

2.2 治療1療程后各組幼鼠不同部位腦組織乙酰膽堿酯酶含量比較 假手術(shù)組、電針組與模型組比較幼鼠腦組織內(nèi)的AChE含量有顯著差異(P<0.01，P<0.05)，在海馬部位針刺組與模型組比較幼鼠腦組織內(nèi)的AChE含量有差異(P<0.05)，在大腦皮層電針組與針刺組比較幼鼠腦組織內(nèi)AChE含量有差異(P<0.05)(見表1)。

注：A:側(cè)腦室周圍白質(zhì)；B：為皮質(zhì)下白質(zhì)。A和B可見組織結(jié)構(gòu)較疏松，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞水腫、炎細(xì)胞浸潤、壞死，有散在神經(jīng)元水腫、壞死，液化壞死灶內(nèi)可見大量小膠質(zhì)細(xì)胞增生。(↑)代表液化壞死區(qū)。 圖1 術(shù)后3 d造模組幼鼠腦組織病理切片(HE×200)

注：A：皮質(zhì)下白質(zhì)；B：腦皮質(zhì)。A和B光鏡檢查未見明顯異常。 圖2 術(shù)后3 d假手術(shù)組幼鼠腦組織病理切片(HE×200)

組 別例數(shù)皮層海馬紋狀體假手術(shù)組80．435±0．1380．741±0．0761．690±0．553模型組120．246±0．100▲▲0．539±0．137▲1．142±0．463▲針刺組120．336±0．120▲0．655±0．156?▲1．324±0．471電針組120．430±0．098??△0．707±0．142?1．592±0．574?

注：與假手術(shù)組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01；與針刺組比較△P<0.05。

3 討論

CP是出生前至生后1個月內(nèi)各種原因引起的腦損傷或發(fā)育缺陷所致的運(yùn)動障礙及姿勢異常的一組綜合征[3]。這是一種涉及運(yùn)動、認(rèn)知、神經(jīng)等領(lǐng)域的小兒主要致殘性疾病，主要表現(xiàn)為中樞性運(yùn)動障礙、姿勢異常及智力障礙。隨著早產(chǎn)兒監(jiān)護(hù)條件和醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，存活率顯著增高，但隨之的早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病率增加，給患者家庭及社會極大的負(fù)擔(dān)。小兒腦癱尚無滿意的治療方法，目前提倡早期綜合治療，電針在長期治療小兒腦癱的臨床實(shí)踐中得到廣泛的認(rèn)可，并認(rèn)為是治療的重要手段之一。

通過結(jié)扎幼鼠頸總動動脈并結(jié)合低氧環(huán)境制作缺氧缺血腦癱模型研究新生兒腦功能障礙的價值已被實(shí)驗(yàn)研究廣泛認(rèn)可。研究認(rèn)為7d大的幼鼠腦組織發(fā)育與新生兒出生時相似[4]，腦組織發(fā)育不健全，易受各種因素影響。腦組織缺血缺氧后表現(xiàn)呈多樣性，但通常特殊性損傷在大腦中動脈及導(dǎo)致腦室周圍白質(zhì)軟化，本實(shí)驗(yàn)HE染色病理切片檢查可見腦室周圍白質(zhì)細(xì)胞水腫、炎細(xì)胞浸潤、液化壞死灶，表明符合缺血缺氧腦癱模型(見圖1)。

AChE作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)廣泛存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞系統(tǒng)中，當(dāng)腦組織受損時膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)必然受影響。在中樞膽堿能神經(jīng)主要分布在容易缺氧缺血的海馬、紋狀體和皮質(zhì)等部位[5]，而這些部位的乙酰膽堿參與錐體外系活動、維持正常覺醒狀態(tài)及學(xué)習(xí)記憶功能。AChE在一定程度上體現(xiàn)膽堿能系統(tǒng)的功能狀況,當(dāng)AChE活力下降時對乙酰膽堿的降解作用降低突觸間隙乙酰膽堿相應(yīng)增高。據(jù)報(bào)道當(dāng)腦組織受損時乙酰膽堿可致興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用加強(qiáng)，谷氨酸及天冬氨酸等興奮性氨基酸對新生兒缺血缺氧損傷后的腦組織發(fā)育有重要作用，谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性中毒是新生兒缺氧缺血白質(zhì)損傷的重要機(jī)制，而AChE可通過降解乙酰膽堿減輕興奮性氨基酸對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[6-7]。并且AChE參與細(xì)胞的發(fā)育和成熟，能促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生[8]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為：腦為“元神”之府，《素問·脈要精微論》指出“頭者，為精明之府”。明代“張介賓”進(jìn)一步指出“五臟六腑之精氣，皆上升于頭”。頭部還是多條經(jīng)脈匯聚之地，《靈樞·邪氣臟腑病形》曰：“十二經(jīng)脈、三百六十五絡(luò)、其氣血皆上于面而走空竅”。因此取頭部穴位進(jìn)行電針刺激，可有效激發(fā)人體的經(jīng)脈氣血、調(diào)整全身經(jīng)脈功能。風(fēng)池透翳風(fēng)穴位于頸部，刺之能調(diào)和陰陽，調(diào)節(jié)臟腑組織器官的功能狀態(tài)。取足陽明胃經(jīng)合穴足三里(即后三里)，針之有補(bǔ)益后天、扶正培元之功。陽明為多氣多血之經(jīng)，陽明經(jīng)氣暢通、旺盛，則利于恢復(fù)運(yùn)動功能，故配合取手足陽明經(jīng)之穴肩髃，曲池、髀關(guān)、合谷、伏兔、解溪等以疏通經(jīng)絡(luò)，滑利關(guān)節(jié)。諸穴合用能達(dá)到益智開竅、疏經(jīng)通絡(luò)，調(diào)和氣血的目的。

本組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，假手術(shù)組、電針組與模型組比較大腦皮層內(nèi)的AChE含量明顯升高，P<0.01，在海馬和紋狀體P<0.05；針刺組與模型比較在海馬部位AChE含量升高P<0.05，在大腦皮層和紋狀體部位AChE含量雖有升高，但P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；電針組與針刺組比較大腦皮層部位AChE含量升高P<0.05，海馬和紋狀體部位AChE含量雖有升高，但P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。針刺、電針均能提高腦癱模型幼鼠腦組織內(nèi)AChE的活性，且電針能顯著提高腦癱模型幼鼠腦組織內(nèi)AChE的活性。提示腦內(nèi)AChE含量升高可能是電針治療小兒腦癱的機(jī)制。

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[2]李曉捷，高晶，孫仁忠.宮內(nèi)感染致早產(chǎn)鼠腦癱動物模型制備及其鑒定的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2004,19(12)：885-889.

[3]中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)會神經(jīng)組.小兒腦癱的定義、診斷條件及分型[J].中華兒科雜志,2005,43(4)：262.

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[收稿2013-01-14;修回2013-04-21]

(編輯：譚秀榮)

Experimentalstudyonthemechanismsofelectro-acupuncturetreatmentofcerebralpalsy

Zhaoguanlei,Chenxuenong

(Department of Acupuncture and Moxibustion, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveToinvestigate the changes of brain acetylcholinesterase(AChE) activity in cerebral palsy rat pupstreated by electro-acupuncture and explore the mechanisms of electro-acupuncture treatment in cerebral palsy.MethodsRat hypoxic and ischemic cerebral palsy model was created by left common carotid artery ligation.Rats were randomly divided into sham-operated group, model group, acupuncture group and electro-acupuncture treatment group. Ten days after treatment, rats were sacrificed and the cortex, hippocampus and striatum were separated.The AChElevel was detected by ELISA.ResultsCompared with the model group, the AChElevel was increased after acupuncture and electro-acupuncture treatment, in which the AChElevel after electro-acupuncture treatment was higher than that after acupuncture treatment. Compared with the model group,the AChElevel in cortex,hippocampus and striatum were increased in sham-operated group and electro-acupuncture treatment group(P<0.01,P<0.05). Furthermore, compared with the model group, the AChElevel in the hippocampus after acupuncture treatment was significantly increased (P<0.05). Compared with the acupuncture group, the AChElevel in the cortex after electro-acupuncture treatment was obviously increased (P<0.05).ConclusionElectro-acupuncture presents a potential benefit for hypoxic and ischemic cerebral palsy treatment and the mechanisms might be due to the increased brain AChE activity.

Cerebral palsy; acupuncture; electro-acupuncture; acetylchlinesterase

R742.3

A

1000-2715(2013)03-0214-04