王正龍，劉志江，趙然尊，郭 艷，石 蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 遵義 563099)

兔心肌梗死再灌注和血管損傷雙模型的建立與評(píng)價(jià)

王正龍，劉志江，趙然尊，郭 艷，石 蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 遵義 563099)

目的制作兔心肌梗死再灌注和血管損傷雙模型，為同步研究心肌梗死后心肌重塑和血管重塑提供可行的動(dòng)物模型。方法選用新西蘭大白兔45只，隨機(jī)分成2組：對(duì)照組(n=5)和模型組(n=40)。模型組用高脂飼料飼養(yǎng)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，然后制備心肌梗死再灌注和頸動(dòng)脈球囊損傷雙模型。采用心電圖、心肌標(biāo)志物和組織病理學(xué)評(píng)價(jià)心肌梗死再灌注模型；采用組織病理學(xué)評(píng)價(jià)頸動(dòng)脈球囊損傷模型。結(jié)果心肌標(biāo)志物升高并隨時(shí)間變化呈動(dòng)態(tài)演變，而且心肌隨時(shí)間變化呈凝固性壞死到纖維疤痕改變；右頸總動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生。結(jié)論心肌梗死再灌注和血管損傷雙模型的建立具有可行性。

心肌梗死再灌注；血管損傷；模型；兔

目前，干細(xì)胞移植對(duì)治療急性心肌梗死的有效性已得到部分證實(shí)[1-7]，然而，其治療中的安全性仍然存在爭(zhēng)議[8-11]，因?yàn)楦杉?xì)胞移植治療在改善心功能的同時(shí)可能會(huì)加重血管重塑。但至今仍少見可用于同步研究干細(xì)胞移植治療心肌梗死后心肌再灌注和血管重塑的動(dòng)物雙模型。因此，本實(shí)驗(yàn)以兔為研究對(duì)象，建立心肌梗死再灌注和血管損傷雙模型，目的是建立可用于同步平行研究干細(xì)胞移植治療心肌梗死后心肌重塑和血管重塑的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 新西蘭大白兔，雄性，45只，體重(3.0±0.3)kg，由遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成二組：對(duì)照組(n=5)和模型組(n=40)，對(duì)照組普通飼料飼養(yǎng)，模型組模型組用高脂飼料飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑、藥品和儀器 高脂飼料主要成份:普通混合飼料、豬油、膽固醇、豬膽鹽(自配)。血清肌鈣蛋白T免疫放射診斷試劑盒(IRMA-cTnT)(北京北方生物技術(shù)研究所)，戊巴比妥鈉(上海試劑廠)，硫化鈉(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)，Kenzcardico302心電圖機(jī)(日本鈴謙株式會(huì)社)，日立7170A全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀(日本日立公司)，球囊導(dǎo)管(美國(guó)Cordis公司)，醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)(德國(guó)Leica Microsystems Ltd)。

1.3 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立心肌梗死再灌注模型 高脂喂養(yǎng)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型[12]后采用開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈法建立心肌梗死再灌注模型。戊巴比妥鈉(10 mg/kg)沿耳緣靜脈注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)板上，前胸及頸部手術(shù)部位常規(guī)備皮去毛(5%Na2S)，消毒，然后鋪洞巾，在無菌條件下，于胸骨旁左側(cè)0.5 cm縱行切口長(zhǎng)約30 cm，離斷胸骨與左第3、4肋交界處，將第3肋骨兩斷端用縫線向兩側(cè)牽引固定，不使用開胸器，盡量保持胸膜完整性，充分暴露心臟，小心提起心包剪開并制備心包吊床，用無齒鑷輕拉左心耳，可清楚暴露兔心臟血管，用小圓針穿眼科4-0縫線，在左室支距離左心耳下緣10 mm處縫扎血管[2]，其末端套內(nèi)徑0.5 cm的硅膠管，通過拉緊絲線阻斷冠脈血流，放松即可恢復(fù)灌注。可見結(jié)扎線以下出現(xiàn)局部心肌紫紺，收縮減弱，心電監(jiān)護(hù)ST段抬高≥2 mm且30 min內(nèi)不回落，初步判斷模型制作成功，結(jié)扎45 min[13]后。放松結(jié)扎線，恢復(fù)心肌血流再灌注，常規(guī)關(guān)閉胸腔。

1.4 球囊損傷頸動(dòng)脈法制作血管損傷模型 心肌梗死再灌注模型建立后在頸正中線上作4～6 cm縱行切口，將右頸總動(dòng)脈暴露至分叉水平。在頸總動(dòng)脈近端和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)端各放一個(gè)動(dòng)脈夾阻斷血流，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，近端逆行插入一根直徑為2.5 mm球囊導(dǎo)管至頸總動(dòng)脈約5.0 cm。連接手推式壓力泵，注入肝素生理鹽水，膨至6個(gè)大氣壓使球囊膨脹[14]，然后沿頸總動(dòng)脈拖動(dòng)5次，使導(dǎo)管損傷的血管區(qū)域達(dá)到4 cm長(zhǎng)度。退出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近端，移去頸總動(dòng)脈近端和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)端動(dòng)脈夾，恢復(fù)血液循環(huán)，常規(guī)縫合頸部皮膚。左頸外動(dòng)脈不做任何處理，作為自身對(duì)照；術(shù)后肌注青霉素80萬(wàn)單位，連續(xù)3 d。

1.5 心電圖檢測(cè) 分別于結(jié)扎前，結(jié)扎后30 min，2周記錄心電圖。全導(dǎo)聯(lián)心電圖動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)阻斷冠脈血流前后心電波形變化。

1.6 心臟標(biāo)志物檢測(cè) 分別從術(shù)前，結(jié)扎冠脈后1 h，3 h，5 h，7 h，2周分別于兔耳緣靜脈取血，檢測(cè)心肌酶和肌鈣蛋白。

1.7 心肌和血管病理組織切片檢測(cè) 結(jié)扎冠脈左室支后1周，4周處死動(dòng)物，每組取4只兔的心臟組織，經(jīng)10%福爾馬林固定，乙醇脫水，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 存活情況 入選40只新西蘭兔建立心肌梗死再灌注和血管損傷雙模型，觀察1月，術(shù)中術(shù)后共死亡8只，死亡率20%，模型成功率80%，其中建立心肌梗死再灌注模型死亡7只(頑固性室顫3只，急性左心衰竭2只，麻醉死亡2只)；建立血管損傷模型無死亡，晚期嚴(yán)重感染死亡1只。

2.2 心電圖結(jié)果 術(shù)前十二導(dǎo)聯(lián)心電圖未見ST段抬高，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左室支后30 min T波升高，ST段抬高，以II、III和aVF及V1-V3明顯；2周后 II、III和aVF及V1-V3形成深而寬的病理性Q波，與結(jié)扎后30 min心電圖比較，II、III和aVF及V1-V3升高的ST段有恢復(fù)(見圖1)。

注：A:正常兔V1、V2、V3導(dǎo)聯(lián)ECG；B:梗死30 min ST段抬高；C:梗死2周ST段抬高下降,寬而深的Q波形成。 圖1 結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈左室支不同時(shí)間心電圖變化特點(diǎn)

2.3 心臟標(biāo)志物結(jié)果 CK、CK-MB及CTnT在心肌梗死模型建立后3 h升高，7～24 h達(dá)高峰，且建模后3 h、5 h、7 h、24 h與建模前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；建模后2周，其值明顯下降，與建模前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) (見表1)。

指 標(biāo)心肌梗死前心肌梗死后3h5h7h24h2周后CK(U/L)1882±304．136872±451．04?12463±563．21?16601±557．28?13674±551．36?2266±268．29CK-MB(U/L)1297±218．486738±331．57?10025±309．15?12168±478．65?9959±389．75?2289±398．36CTnT(mg/l)0．00±0．00 3．96±0．06? 7．11±0．11? 4．58±0．07? 1．81±0．04?0．00±0．00

注：與心肌梗死前比較*P<0.05。

2.4 心肌病理 正常兔心肌纖維排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無纖維疤痕組織增生；心肌梗死再灌注后1周，可見典型的心肌細(xì)胞凝固性壞死；心肌梗死再灌注后4周，左心室游離壁心肌組織大量壞死，由纖維疤痕組織所取代，存活的少量心肌組織被分隔成島狀，散在分布(見圖2)。

注：A:正常兔心肌組織；B:梗死1周典型凝固壞死形成,局部較多炎性細(xì)胞侵潤(rùn)；C:梗死4周局部纖維瘢痕形成。 圖2 結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈左室支不同時(shí)間心肌病理變化特點(diǎn)(HE×100)

2.5 血管損傷結(jié)果 血管損傷后1月行組織病理學(xué)檢查見內(nèi)膜增生明顯(見圖3)。

注：A:正常兔頸動(dòng)脈；B:球囊損傷頸動(dòng)脈,可見內(nèi)膜增生明顯。 圖3 球囊損傷頸動(dòng)脈4周內(nèi)膜病理變化特點(diǎn)(HE×200)

3 討論

3.1 建模方法的選擇及意義 心肌梗死動(dòng)物模型在心肌梗死發(fā)生機(jī)理及其治療方法的研究中具有重要作用，目前，心肌梗死模型有4種方法[13]：①通過轉(zhuǎn)基因或基因敲除等方法；②藥物(垂體后葉素、異丙腎上腺素、麥角新堿)注射法；③液氮冷凍法及電凝法； ④人工阻塞左冠狀動(dòng)脈，包括冠狀動(dòng)脈結(jié)扎或夾閉術(shù)及冠狀動(dòng)脈阻塞術(shù)。這些方法中各有其優(yōu)缺點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因或基因敲除法可造成嚴(yán)重的高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化，繼而引起心肌梗死，特點(diǎn)在于接近人類發(fā)病的過程。然而，因該方法復(fù)制的動(dòng)物模型其冠狀動(dòng)脈閉塞的時(shí)間和位置變異性大，可控性差，同時(shí)其費(fèi)用高，需時(shí)長(zhǎng)，因此，不適合用于心肌梗死相關(guān)的心肌重塑研究。藥物注射法通過增加心肌氧耗和誘發(fā)冠脈痙攣導(dǎo)致心肌缺血，因其存在不安全性和所制模型梗死區(qū)域難定位的缺陷，已很少被實(shí)驗(yàn)者采用；冷凍法通過超低溫使心肌細(xì)胞凍傷壞死，這與血流中斷引起的心梗發(fā)生過程有較大差異。人工阻塞左冠狀動(dòng)脈法可使動(dòng)物造成急性或慢性心肌缺血及梗死，在諸多方法中，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法有較多優(yōu)點(diǎn)，如梗死的部位及時(shí)間容易控制，可以復(fù)制與心肌梗死患者極為類似的動(dòng)物模型，因此，至今冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法仍是經(jīng)典的首選方法[13]。

3.2 模型的可行性分析 建立的動(dòng)物模型具有可行性的關(guān)鍵之一是如何降低動(dòng)物的死亡率。本實(shí)驗(yàn)共入選40只新西蘭兔建立心肌梗死再灌注和血管損傷雙模型，觀察1月，術(shù)中、術(shù)后共死亡8只，其中建立心肌梗死再灌注模型死亡7只(頑固性室顫3只、急性左心衰竭2只、麻醉意外2只)；建立血管損傷模型時(shí)無死亡，晚期嚴(yán)重感染死亡1只，死亡率為20.0%，模型成功率80%。

通過本實(shí)驗(yàn)體會(huì)，影響模型動(dòng)物存活率主要與以下幾個(gè)因素有關(guān)：①結(jié)扎部位選擇；②麻醉；③手術(shù)操作技能及無菌技術(shù)；④術(shù)后抗感染；⑤其它如術(shù)中保溫、術(shù)中術(shù)后護(hù)理等，其中，結(jié)扎部位的選擇是提高手術(shù)后成活率的重要措施。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左室支的中上1/3處(距左心耳下緣3～5 mm)，術(shù)中心電圖檢測(cè)可見較廣泛的ST段呈弓背向上抬高，尤以II、III、aVF及V1-V6明顯，在幾分鐘內(nèi)，因心室纖顫而死亡，死亡率幾乎達(dá)100%。后來，降低結(jié)扎部位，改在冠狀動(dòng)脈左室支距離左心耳下緣10 mm處縫扎血管，死亡率明顯下降，飼養(yǎng)1月，存活率可達(dá)60%。通過加強(qiáng)麻醉、手術(shù)操作技能及無菌技術(shù)、抗炎等綜合措施，然后觀察1月，模型成功率達(dá)到80%，提示建立心肌梗死再灌注和血管損傷雙模型具有可行性。

可靠的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)是判斷模型建立成功的重要方面。目前認(rèn)為心電圖，心肌標(biāo)志物及病理檢查結(jié)合是判斷心肌梗死模型成功建立的金標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)通過心電圖，心肌標(biāo)志物及病理檢查確定心肌梗死再灌注模型成功建立；同時(shí)從頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后伊文思藍(lán)染色特點(diǎn)和病理結(jié)果提示血管損傷模型建立成功。

3.3 本實(shí)驗(yàn)特點(diǎn) 近年來，PCI已成為冠心病治療的重要手段。新近國(guó)內(nèi)外許多研究表明，干細(xì)胞移植治療心肌梗死能改善心功能，但是在應(yīng)用安全性方面存在爭(zhēng)議。我們?cè)谔剿鞲杉?xì)胞移植治療急性心肌梗死中的有益作用的同時(shí)，需要明確其在治療中是否會(huì)加重急性心肌梗死后損傷血管的重塑。有文獻(xiàn)報(bào)道G-CSF誘導(dǎo)和動(dòng)員的骨髓造血祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為血管平滑肌細(xì)胞會(huì)加重再狹窄，因而，干細(xì)胞移植治療心肌梗死可能會(huì)加劇冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊形成和再狹窄的發(fā)生[15]。因此，有必要在同一個(gè)體內(nèi)同步研究心肌梗死后干細(xì)胞對(duì)心肌重塑的有效性和安全性。既往制作的動(dòng)物模型多集中在干細(xì)胞治療心肌梗死方面，對(duì)于心肌梗死后同步觀察心肌重塑和血管重塑方面的研究較少，而長(zhǎng)期以來制作的心肌梗死模型多采用持續(xù)性冠狀動(dòng)脈阻斷的方法，不能準(zhǔn)確反應(yīng)臨床上許多急性心肌梗死患者已進(jìn)行冠脈內(nèi)再灌注治療(PCI或CABG)的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以兔為研究對(duì)象，在動(dòng)脈粥樣硬化頸動(dòng)脈狹窄基礎(chǔ)上，采用開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈法構(gòu)建心肌梗死動(dòng)物模型，在結(jié)扎血管45 min后，恢復(fù)心肌血流灌注。在心肌梗死后恢復(fù)心肌再灌注，這更符合臨床上急性心?；颊呔o急開通血管，恢復(fù)心肌血流灌注的特點(diǎn)。該模型在建立心肌梗死模型成功后采用球囊損傷狹窄的頸動(dòng)脈，這模擬了臨床患者PCI治療模式，為在同一個(gè)體中同步平行研究心肌梗死后心肌重塑(心力衰竭)和血管重塑(PCI術(shù)后再狹窄)的實(shí)驗(yàn)研究提供重要的意義。

綜上所述，建立心肌梗死再灌注和血管損傷雙模型具有可行性。

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[收稿2013-02-12;修回2013-04-21]

(編輯：譚秀榮)

Establishmentandevaluationofrabbitmyocardialinfarctionreperfusionwithvascularinjurymodel

Wangzhenglong,Liuzhijiang,Zhaoranzun,Guoyan,Shibei

(Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo establish rabbit myocardial infarction reperfusion with vascular injury model.MethodsForty-five New Zealand white rabbits were randomly divided into the control group (n=5) and model group (n=40) fed with high-fat diets to establish atherosclerosis model followed by the myocardial infarction reperfusion-induced injury by thoracotomy and ligating left ventricular branch of coronary artery and the subsequent carotid artery balloon injury. ECG, cardiac markers and histopathological examinations were performed to evaluate the model establishment.ResultsCompared with the control group, the cardiac markers were time-dependently increased with dynamic development and the time-dependent change from necrosis to fibrous scar was presented and carotid artery showed intimal hyperplasia in the model group.ConclusionIt is feasible to eatablish myocardial infarction reperfusion with vascular injury model.

Myocardial infarction reperfusion; vascular injury; model; rabbit

R 541

A

1000-2715(2013)03-0193-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81060014)。

石蓓，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：冠心病介入治療,E-mail:shibei2147@163.com。