汪燕妮，黨瑜慧，劉佳微，吳 雙，劉玲飛，李芝蘭

蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅 730000

目前，絕大多數(shù)的避孕措施都主要以女性使用為主，特別是避孕藥物的使用。到目前為止，我國國內(nèi)尚未見到一種效果好、低副作用、被廣泛認(rèn)可的男性避孕藥物。芹菜素作為一種天然存在的植物黃酮，廣泛存在于各類水果、蔬菜和豆類中，特別是芹菜中含量最為豐富。研究證明具有抗氧化功能、抑制致癌物質(zhì)、抗炎等多種生物學(xué)和藥理學(xué)作用［1-3］。

有研究顯示健康成年男性每日攝食芹菜75 g，連續(xù)1～2周后，精子數(shù)量會(huì)明顯減少到難以受孕的程度，這種情況在停食芹菜后幾個(gè)月又會(huì)恢復(fù)正常［4］。但具體是芹菜中哪種成分在起關(guān)鍵作用尚未定論。本研究通過觀察芹菜素對(duì)成年雄性小鼠的血清睪酮(Testosterone，T)、雌二醇(Estradiol，E2)、雌二醇/睪酮(E2/T)以及精子密度和活動(dòng)率的影響，探討芹菜素對(duì)生殖功能影響的機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步研究開發(fā)芹菜素的藥用價(jià)值提供一定的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康SPF級(jí)昆明種雄性小鼠120只，體重(28.20±3.55)g，周齡6～8周(甘肅中醫(yī)學(xué)院提供)，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(甘)2011-0001-0001067，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施使用證明號(hào):SCXK(甘)2011-0001-0002756。

每天定時(shí)給予對(duì)照組0.01 mL/g bw生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組給予0.01 mL/g bw不同劑量(低劑量組252 mg/L，中劑量組504 mg/L，高劑量組1008 mg/L)的芹菜素混懸液灌胃。連續(xù)灌胃 7、14、21 d后分批內(nèi)眥靜脈叢取血后脫臼處死小鼠，分離附睪、睪丸，分別稱重，計(jì)算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器濕重/動(dòng)物體重)。

1.2 儀器與材料

WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司);JA3003 N電子秤(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DK-600S型三用恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。芹菜素購于陜西慧科植物開發(fā)有限公司，純度98%，灌胃時(shí)用蒸餾水配成所需濃度。睪酮、雌二醇放射免疫分析藥盒，JA3003N電子秤(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，GC-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器。

1.3 分組與方法

將小鼠按體重隨機(jī)分為4組:陰性對(duì)照組(生理鹽水)、低劑量組(252 mg/L芹菜素)、中劑量組(504 mg/L芹菜素)和高劑量組(1008 mg/L芹菜素)，每組各30只。動(dòng)物飼養(yǎng)在甘肅省中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。每天定時(shí)給陰性對(duì)照組0.01 mL/g bw生理鹽水灌胃，各劑量組給予0.01 mL/g bw不同濃度的芹菜素灌胃，每天1次。連續(xù)灌胃7、14、21 d后分批小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血后脫臼處死小鼠，所取血液放入離心管采用低速離心機(jī)(3000 rpm，5～6 min)，靜置分層，吸取上層血清，采用放射免疫學(xué)方法(RIA)，利用GC-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器進(jìn)行血清中睪酮(T)和雌二醇(E2)濃度的測(cè)定。分離附睪、睪丸，分別稱重，計(jì)算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器濕重/動(dòng)物體重)。左側(cè)附睪稱重后立即放入盛有1 mL 0.86%的生理鹽水平皿中，用眼科剪刀橫向剪開3個(gè)切口，放置37℃水浴箱中，30 min后用微量移液器吸取10 μL精子懸液，應(yīng)用WL JY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)(CASA)測(cè)定精子密度、活動(dòng)率等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)各組小鼠臟器系數(shù)的影響

經(jīng)單因素方差分析，芹菜素7、14、21 d處理組，各劑量組睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)與同期陰性對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，由表1可見。

表1 芹菜素對(duì)小鼠睪丸、附睪系數(shù)的影響(n=10，±s)Table 1 Effect of apigenin on testis index and epididymis index(n=10，±s)

表1 芹菜素對(duì)小鼠睪丸、附睪系數(shù)的影響(n=10，±s)Table 1 Effect of apigenin on testis index and epididymis index(n=10，±s)

天數(shù)Days分組Group睪丸濕重Testis wet weight睪丸系數(shù)Testis index(×10-3)附睪濕重Epididymis wet weight附睪系數(shù)Epididymis index(×10-3)7 d 對(duì)照組Negative control 0.18±0.05 6.71±1.96 0.06±0.02 2.33±0.50低劑量組Low-dose group 0.18±0.04 6.79±1.31 0.07±0.02 2.55±0.63中劑量組Medium-dose group 0.19±0.05 7.30±1.95 0.07±0.01 2.73±0.56高劑量組High-dose group 0.20±0.05 8.05±1.51 0.07±0.02 2.91±1.04 14 d 對(duì)照組Negative control 0.21±0.03 5.88±0.96 0.08±0.02 2.25±0.54低劑量組Low-dose group 0.27±0.20 6.42±1.08 0.08±0.01 2.20±0.37中劑量組Medium-dose group 0.21±0.04 6.79±1.11 0.08±0.02 2.38±0.51高劑量組High-dose group 0.21±0.03 6.30±1.13 0.08±0.01 2.28±0.33

21 d 對(duì)照組Negative control 0.22±0.05 5.73±1.25 0.09±0.02 2.22±0.36低劑量組Low-dose group 0.24±0.05 6.00±1.04 0.10±0.02 2.36±0.54中劑量組Medium-dose group 0.23±0.03 5.84±1.04 0.09±0.02 2.22±0.42高劑量組High-dose group 0.22±0.04 5.36±0.86 0.09±0.02 2.25±0.50

2.2 芹菜素對(duì)小鼠血清性激素的影響

小鼠血清T濃度7 d無明顯變化，14 d各劑量組均低于對(duì)照組(P=0.000)，高劑量組低于中劑量組和低劑量組(P＜0.05);21 d T濃度中、低劑量組都低于對(duì)照組(P＜0.05)。14 d小鼠血清T濃度隨芹菜素濃度增加出現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。小鼠血清E2濃度7、14、21 d各劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。E2/T 14 d高劑量組高于中、低劑量組和對(duì)照組(P＜0.05)。其變化與14 d血清T濃度高劑量組明顯降低相一致。

表2 芹菜素對(duì)小鼠血清性激素的影響(n=10，±s)Table 2 Effect of apigenin on sex hormones(n=10，±s)

表2 芹菜素對(duì)小鼠血清性激素的影響(n=10，±s)Table 2 Effect of apigenin on sex hormones(n=10，±s)

注:與對(duì)照組比較 *P＜0.05;＊＊P ＜0.01;#:與低劑量組和中劑量組比較P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05;＊＊P ＜ 0.01;#:Compare with low-dose and medium-dose group P ＜ 0.05.

天數(shù)Days分組group T(ng/dl)E2(pg/mL) E2/T 7 d 對(duì)照組Negative control 10.57±4.85 7.64±3.24 0.67±0.29低劑量組Low-dose group 11.08±4.37 5.03±1.48 0.54±0.30中劑量組Medium-dose group 16.00±3.67 6.05±1.57 0.49±0.25高劑量組High-dose group 15.22±7.71 6.82±2.15 0.51±0.22 14 d 對(duì)照組Negative control 19.67±5.83 4.37±1.11 0.25±0.11低劑量組Low-dose group 12.69±6.18＊＊ 3.12±0.58 0.26±0.12中劑量組Medium-dose group 12.25±3.66＊＊ 5.39±1.49 0.35±0.09高劑量組High-dose group 7.61±1.46＊＊# 5.11±1.96 0.69±0.19*21 d 對(duì)照組Negative control 33.12±7.49 4.69±1.53 0.15±0.05低劑量組Low-dose group 19.36±8.37* 3.93±1.35 0.21±0.13中劑量組Medium-dose group 20.04±7.14* 2.63±1.41* 0.17±0.12高劑量組High-dose group 29.88±9.48 4.14±1.17 0.14±0.05

2.3 芹菜素對(duì)小鼠精子活動(dòng)率的影響

14 d低、中、高劑量組的a級(jí)精子百分率低于同期陰性對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。21 d低、中、高劑量組的a級(jí)精子百分率低于同期陰性對(duì)照組(P＜0.05)，表3。14、21 d各劑量組小鼠精子活力低于同期陰性對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表4。

表3 芹菜素對(duì)小鼠精子活動(dòng)度影響(n=10，±s)Table 3 Impact of apigenin on mice sperm motility(n=10，±s)

表3 芹菜素對(duì)小鼠精子活動(dòng)度影響(n=10，±s)Table 3 Impact of apigenin on mice sperm motility(n=10，±s)

天數(shù)Days分組Group n 精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)分布Grade of sperm(%)a b c d 7 d 對(duì)照組Negative control 10 7.92±5.18 8.51±5.78 32.30±15.28 51.28±22.93低劑量組Low-dose group 10 8.25±4.09 9.38±4.18 28.53±12.89 53.84±14.58中劑量組Medium-dose group 10 13.62±7.80 14.47±9.50 42.91±12.74 29.00±11.87高劑量組High-dose group 10 8.63±6.56 10.94±5.13 34.55±14.56 45.88±16.17 14 d 對(duì)照組Negative control 10 8.56±3.98 11.82±3.88 32.97±8.21 46.65±9.80低劑量組Low-dose group 10 5.98±1.93 10.20±4.24 40.25±6.24 45.58±7.64中劑量組Medium-dose group 10 6.88±3.84 8.92±3.23 35.60±10.01 48.37±12.44高劑量組High-dose group 10 7.44±4.57 12.40±4.24 37.14±11.21 43.02±12.58

注:與陰性對(duì)照組比較，*:P﹤0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

2.4 芹菜素對(duì)小鼠精子密度的影響

7、14、21 d小鼠精子密度各劑量組與同期對(duì)照 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 芹菜素對(duì)小鼠精子密度及活動(dòng)率的影響(n=10，±s)Table 4 Effect of apigenin on sperm density and motility ratio(n=10，±s)

表4 芹菜素對(duì)小鼠精子密度及活動(dòng)率的影響(n=10，±s)Table 4 Effect of apigenin on sperm density and motility ratio(n=10，±s)

天數(shù)Days分組Group精子密度(×10-9)Sperm density(×10-9)精子活力(a+b%)級(jí)Grade a+b(%)精子活率(a+b+c%)級(jí)Grade a+b+c(%)7 d 對(duì)照組Negative control 1.26±0.42 16.05±10.82 48.72±22.93低劑量組Low-dose group 1.37±0.76 17.63±6.82 46.16±14.58中劑量組Medium-dose group 1.16±0.98 28.09±16.04 71.00±11.87高劑量組High-dose group 1.31±1.07 24.19±14.24 54.12±16.17 14 d 對(duì)照組Negative control 3.18±1.17 20.38±5.98 53.35±9.80低劑量組Low-dose group 3.11±0.33 16.18±5.40 54.42±7.64中劑量組Medium-dose group 2.57±0.94 16.02±5.21 51.63±12.44高劑量組High-dose group 2.46±0.94 19.84±8.31 56.98±12.58 21 d 對(duì)照組Negative control 3.35±1.00 19.51±8.18 65.74±11.47低劑量組Low-dose group 3.34±0.81 15.30±5.39 59.28±12.77中劑量組Medium-dose group 2.88±0.55 17.34±5.65 64.11±14.39高劑量組High-dose group 2.84±0.73 15.84±3.96 55.96±9.60

3 討論

目前，男性可采用的避孕和節(jié)育方法包括體外排精、陰莖套、安全期避孕法和輸精管結(jié)扎術(shù)。雖然激素避孕成功用于女性已有40余年，但男性激素避孕的研究直到近年才有所發(fā)展［5，6］，但至今在世界范圍內(nèi)還沒有一種成熟的、市場(chǎng)化的男性避孕藥品。在傳統(tǒng)避孕藥的基礎(chǔ)上，利用植物活性物質(zhì)開發(fā)安全、有效的避孕藥已經(jīng)成為一種發(fā)展趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素作為一種天然物質(zhì)，對(duì)男性的精子的生成具有明顯抑制作用［4］。本研究旨在針對(duì)芹菜素對(duì)精子質(zhì)量影響的機(jī)制作進(jìn)一步探討，進(jìn)一步開發(fā)芹菜素的藥用價(jià)值。

臟器系數(shù)的變化可近似反映該臟器的功能狀態(tài)和病變情況。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芹菜素7、14、21 d各劑量組小鼠睪丸和附睪的臟器系數(shù)與陰性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示本實(shí)驗(yàn)劑量的芹菜素對(duì)小鼠睪丸和附睪無明顯影響。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)給小鼠芹菜素灌胃14 d后，小鼠血清T濃度降低，并呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，即隨芹菜素劑量的增加，小鼠血清T濃度降低(P＜0.05)。21 d低、中劑量組低于對(duì)照組(P＜0.05)。提示隨著芹菜素?cái)z入量的增加，芹菜素對(duì)雄性小鼠睪酮的分泌具有明顯抑制作用。而高濃度的雄性激素環(huán)境是精子產(chǎn)生的必要條件，與睪酮降低相一致，小鼠a級(jí)精子百分率21 d各劑量組均低于同期陰性對(duì)照組(P＜0.01)。14 d各劑量組也低于同期陰性對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示芹菜素對(duì)小鼠睪酮有明顯的降低作用，進(jìn)一步影響小鼠精子的生成，特別是a級(jí)精子的生成，從而起到避孕的作用。并且從本次實(shí)驗(yàn)推測(cè)，睪酮的降低到影響精子的生成需要近7 d的周期。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的其他結(jié)果(精子運(yùn)動(dòng)參數(shù))，推測(cè)芹菜素降低小鼠精子質(zhì)量的作用主要是由于抑制了睪酮的生成。

Shivayogi P.等研究發(fā)現(xiàn)芹菜素對(duì)雌性大鼠有雌激素和抗雌激素樣作用［7］，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未顯示芹菜素對(duì)雄性小鼠血清E2含量產(chǎn)生明顯的影響。

1 Noroozi M，Angerson WJ，Lean ME.Effects of flavonoids and vitamin C on oxidative DNA damage to human lymphocytes.Am J Clin Nutr，1998，67:1210-1218.

2 Prior RL，Cao G.Antioxidant capacity and polyphenolic components of teas:implications for altering in vivo antioxidant status.Proc Soc Exper Biol Med，1999，220:255-261.

3 Conney AH，Lu Y，Lou Y，et al.Inhibitory effect of green and black tea on tumor growth.Proc Soc Exper Biol Med，1999，220:229-233.

4 Gao JY(高金燕)，Chen HB(陳紅兵).Research progress of active constituent in celery.Food Nutri China(中國食品與營養(yǎng))，2005，7:29-31.

5 WHO task force on methods for the regulation of male fertility.Contraceptive efficacy testosterone-induced azoospermia in normal men.Lancet，1990，336:955-959.

6 Zhang RD(張仁東).Research progress of homone contraceptive methods in normal men.Chin J Family Plan(中國計(jì)劃生育雜志)，2004，12:758-761.

7 Shivayogi P.Antifertility and hormonal properties of flavones of trigaoroban-chioide.Eur J Pharmacol，2000，391:193-197.