高程海，易湘茜，林 琳，3，謝文佩，3，龍 彬，3，王一兵*

1廣西科學(xué)院廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗，南寧 530007;2廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001;3廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004

在開發(fā)和利用海洋的歷史進(jìn)程中，人類一直面臨著防除海洋污損生物附著問題，采用防污劑制成防污涂料是經(jīng)濟(jì)和技術(shù)上最可行有效的手段。有機(jī)錫和氧化亞銅涂料曾經(jīng)是最有效的防污涂料，但是都由于不良生態(tài)環(huán)境影響已經(jīng)或準(zhǔn)備被禁止使用。針對這種現(xiàn)狀，尋找一種環(huán)境友好型的高效抗海洋生物污損物質(zhì)具有特殊的重要性和迫切性。海洋天然產(chǎn)物防污劑以其易降解、無毒、高效的特點而倍受關(guān)注。目前，已從多種海洋動植物中獲得了一系列如甾類、萜類、肽類、生物堿類等具有抗海洋生物污損附著活性的海洋天然產(chǎn)物［1］。

鄰苯二甲酸酯類(PAEs)化合物又稱增塑劑或塑化劑，自2011年中國臺灣地區(qū)爆出在飲料中非法添加以來，在多種食品、藥品、保健品、化妝品中均被檢出。今年11月以來，國內(nèi)高濃度白酒也被報道塑化劑超標(biāo)，造成消費(fèi)者聞之色變。然而，常用作增塑劑的PAEs一直存在著天然來源［2］，近些年也經(jīng)常從各種海洋生物中分離獲得［3-6］。研究表明，PAEs作為海洋生物的次生代謝產(chǎn)物，有抗海洋污損生物附著的功能［6］。本文報道了三種海洋生物中的鄰苯二甲酸酯類化合物分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定過程，并測試其抗海洋污損生物附著能力以及構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Brucker Avance 600型核磁共振波譜儀，TMS為內(nèi)標(biāo);waters 2695(PDA檢測器，10 mm×250 mm，5 um，Phenomenex);無菌操作臺SYD001(蘇州億達(dá)凈化設(shè)備有限公司);生化培養(yǎng)箱LRH-250A(廣東省醫(yī)療器械廠);雙層恒溫培養(yǎng)震蕩器ZHWY-2112C(上海智城分析儀器有限公司);高壓滅菌鍋HVE-50(日本 HIRAYAMA公司);超聲波細(xì)胞破碎儀VCX-500(美國SONICS公司);薄層色譜硅膠與柱層析硅膠(青島海洋化工廠);Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech.Sweden);高效液相色譜用試劑為色譜純，所用試劑均為分析純。

1.2 生物材料

細(xì)菌菌株從廣西潿洲島海域采集的柳珊瑚Anthogorgia caerulea中分離，采用16S rRNA鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

柳珊瑚樣品于2010年8月采自廣西潿洲島海域，由中國科學(xué)院南海海洋研究所李秀寶博士鑒定為Anthogorgia caerulea。

真菌菌株從香港西貢紅樹林附近海水中分離得到，通過分析菌落形態(tài)，采用形態(tài)學(xué)檢驗確定Cladosporium sp.。

1.3 發(fā)酵、提取和分離

枯草芽孢桿菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)(培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L;培養(yǎng)條件:30℃，150 rpm)，獲得60 L發(fā)酵液。用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，萃取液經(jīng)真空濃縮后得到萃取部位4.6 g。采用硅膠柱層析萃取部位，以石油醚-丙酮系統(tǒng)(100∶0～0∶100)梯度洗脫，得到E1～E35共35個流份。E8～E10流份經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(50∶50)等梯度梯度洗脫得到化合物1(4.8 mg)。E17流份經(jīng)過半制備HPLC進(jìn)行分離后，得到化合物2(3.9 mg)和3(4.2 mg)。

柳珊瑚Anthogorgia caerulea(濕重約5.0 kg)切碎，用乙醇-二氯甲烷(V∶V=1∶1)混合溶劑浸泡三次，每次一周，將所得粗提物加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，減壓回收試劑，得乙酸乙酯萃取物24.82 g。將乙酸乙酯萃取物裝入硅膠柱層析，以CHCl3-Me2CO系統(tǒng)(100∶0～50∶50)和CHCl3-MeOH系統(tǒng)(90∶10～0∶100)依次梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜檢測后，合并近似流份，共得到10個分離部位(A-J)。組分E經(jīng)凝膠柱層析后，再用制備薄層色譜制備分離得到化合物4(2.6 mg)。組分J經(jīng)硅膠柱層析后，再用半制備高效液相色譜進(jìn)行分離，得化合物5(10.0 mg)。

Cladosporium sp.F14經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)(酵母浸粉0.4%，麥芽粉0.5%，葡萄糖0.4%，海鹽1.8%)后，獲得120 L發(fā)酵液。乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，再經(jīng)真空濃縮得萃取相8.7 g。采用硅膠柱(200～300目)層析萃取部位，合并近似流份，得到9個分離部位(gf1-gf 9)。gf 6經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿和甲醇混合溶劑(V∶V=1∶0.05 ～1∶0.5)洗脫后，經(jīng)薄層色譜檢測后，合并為5個流份。流份gf 6-2經(jīng)過半制備HPLC進(jìn)行分離后，得到化合物6(5.0mg)。部位gf 6-4經(jīng)過半制備HPLC進(jìn)行分離后，得到化合物7(6.8 mg)和8(5.3 mg)。

1.4 抗污損生物幼蟲附著活性篩選

1.4.1 幼蟲的培養(yǎng)

藤壺幼蟲的培養(yǎng)根據(jù) Thiyagarajan等［7］方法，在附著測試之前，處于介蟲狀態(tài)的藤壺幼蟲在8℃黑暗環(huán)境中放置4 d。

1.4.2 抗幼蟲附著活性篩選

化合物1～8分別溶解于DMSO溶液中，用無菌海水配制成 100、50、25 μg/mL、12.5、6.25、3.13、1.57 μg/mL共7個濃度梯度。在24孔板的每個孔中加入1 mL配制好的測試樣品(采用DMSO溶解)和20個游動藤壺幼蟲，每個樣品做4個平行，加含有1 mL DMSO的無菌海水作為陰性對照。配有測試樣品的24孔板放于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為28℃，避光放置24 h后，觀察實驗結(jié)果。通過顯微鏡觀察逐個記錄已附著在板壁上的幼蟲個數(shù)和沒有附著在板壁上的幼蟲個數(shù)以及已死亡的幼蟲個數(shù)。統(tǒng)計已附著在板壁上的幼蟲個數(shù)占實驗用總幼蟲個數(shù)的百分比，通過EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM Version 1.5軟件計算受測化合物的EC50和LC50。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds of 1-8

化合物1 無色油狀;分子式C24H38O4;TLC檢驗，紫外254 nm處有吸收，5%磷鉬酸乙醇溶液加熱不顯色;ESI-MS m/z:390.9［M+H］+;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δH:7.72(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3，6)，7.63(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-4，5)，4.00(4H，s，H-1'，1'')，1.68(2H，m，H-2'，2')，1.43(4H，m，H-a'，a'')，1.37(4H，m，H-3'，3'')，1.32(8H，m，H-4'，4''，5'，5'')，0.90(12H，m，H-6'，6''，b'，b'');13C NMR(150 MHz，CD3OD)δC:169.8(CO)，133.6(C-4，5)，132.5(C-1，2)，129.9(C-3，6)，69.1(C-1'，1'')，40.2(C-2'，2'')，31.6(C-3'，3'')，30.0(C-4'，4'')，23.8(C-5'，5'')，14.5(C-6'，6'')，24.7(C-a'，a'')，11.8(C-b'，b'')。上述氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3］一致，故鑒定化合物1為鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯。

化合物2 無色油狀;分子式C20H30O4;ESI-MS m/z:334.2 ［M ］+，267.5，228.1，205.4，106.5，149.8，76.7;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δH:7.71(2H，dd，J=6.0，3.6 Hz，H-3，6)，7.53(2H，dd，J=6.0，3.6 Hz，H-4，5)，4.29(4H，t，J=6.6 Hz，H-1')，4.23(2H，m，H-1'')，1.68(3H，m，H-2'，2'')，1.43(4H，m，H-3'，a'')，1.32(6H，m，H-3''，4''，5'')，0.93(9H，m，3 × CH3，H3-4'，6''，b'');13C NMR(150 MHz，CD3OD)δC:168.6(CO)，132.6(C-4)，132.5(C-5)，131.0(C-1，2)，130.0(C-3，6)，68.3(C-1'')，65.7(C-1')，38.9(C-2'')，30.7(C-2')，30.5(C-3'')，29.9(C-4'')，23.9(C-a'')，23.1(C-5'')，19.3(C-3')，13.8(C-4'，6'')，11.1(C-b'')。上述氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］一致，故鑒定化合物2為2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1，8-dicarboxylate。

化合物3 無色油狀物;分子式 C16H22O4;熔點:327℃，ESI-MS m/z:278.3［M］+;1H NMR(600 MHz，CDC13)δH:7.72(2 H，dd，J=6.0，3.3 Hz，H-3，6)，7.53(2H，dd，J=6.0，3.3 Hz，H-4，5)，4.17(4H，d，J=6.5 Hz，H-1'，1'')，2.01(2H，m，H-2'，2'')，0.95(12H，d，J=6.5 Hz，H-3'，3''，a'，a'')。13C NMR(150 MHz，CDCl3) δC:167.1(CO)，132.0(C-4，5)，128.9(C-1，2)，129.0(C-3，6)，71.4(C-1'，1'')，27.6(C-2'，2'')，19.0(C-3'，3''，a'，a'')。上述氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］一致，故鑒定化合物3為鄰苯二甲酸二異丁酯。

化合物4 無色油狀;分子式C16H22O4;ESI-MS m/z:301.2［M+Na］+，579.3［2M+Na］+;1H NMR(600 MHz，CDCl3)δH:7.71(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3，6)，7.52(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-4，5)，4.30(4H，t，J=6.7 Hz，H-1'，1'')，1.71(4H，m，H-2'，2'')，1.44(4H，m，H-3'，3'')，0.96(6H，t，J=7.4 Hz，H-4'，4'');13C NMR(150 MHz，CDCl3)δC:167.9(CO)，132.4(C-4，5)，131.1(C-1，2)，129.0(C-3，6)，65.7(C-1'，1'')，30.7(C-2'，2'')，19.3(C-3'，3'')，13.9(C-4'，4'')。上述氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］一致，故鑒定化合物4為鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物5 無色油狀;分子式C24H38O4;ESI-MS m/z:335.4［M+H］+;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δH:7.72(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3，6)，7.63(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-4，5)，4.19(4H，m，H-1'，1'')，1.87(2H，m，H-2'，2'')，1.43(8H，m，H-4'，4''，b'，b'')，1.32(8H，m，H-3'，3''，a'，a'')，0.94(12H，m，H-5'，5''，c'，c'');13C NMR(150 MHz，CD3OD)δC:169.4(CO)，133.6(C-4，5)，132.5(C-1，2)，129.9(C-3，6)，69.1(C-1'，1'')，38.7(C-2'，2'')，32.6(C-3'，3''，a'，a'')，24.0(C-4'，4''，b'，b'')，14.8(C-5'，5''，c'，c'')。上述氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］一致，故鑒定化合物5為鄰苯二甲酸二(2-丙基)戊酯。

化合物6 無色油狀物;分子式C20H30O4;EIMS m/z 334.2 ［M］+。IR(KBr)νmax:3441，2954，2922，2867，1722，1597，1570，1 470，1130 cm-1。1H NNR(600 MHz，CDCl3)δ:7.81(2H，dd，J=6.0，3.5 Hz，H-3，6)，7.78(2H，dd，J=6.0，3.5 Hz，H-4，5)，4.32(4H，m，H-1'，l'')，1.65(2H，m，H-2'，2'')，1.52(8H，m，H-3'，3''，a'，a'')，0.91(6H，t，J=4.5 Hz，H-4'，4'')，0.96(6H，t，J=4.5 Hz，H-b'，b'')。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:168.1(C=O)，132.0(C-1，2)，131.2(C-3，6)，128.2(C-4，5)，68.4(C-1'，l')，38.0(C-2'，2'')，30.7(C-3'，3'')，14.0(C-4'，4'')，23.7(C-a'，a'')，12.1(C-b'，b'')。上述氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10-11］一致，故鑒定化合物6為鄰苯二甲酸二(2-乙基)丁酯。

化合物7 無色油狀物;分子式C30H50O4;EIMS m/z 474.3 ［M］+。1H NNR(600 MHz，CDCl3)δ:7.69(2H，dd，J=6.0，3.5 Hz，H-3，6)，7.61(2H，dd，J=6.0，3.5 Hz，H-4，5)，4.21(4H，m，H-1'，l'')，1.70(2H，m，H-2'，2'')，1.42(24H，m，H-3'，3''，4'，4''，5'，5''，6'，6''，8'，8''，a'，a'')，0.85(6H，t，J=4.5 Hz，H-9'，9'')，0.90(6H，t，J=4.5 Hz，H-b'，b'')。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:168.1(C=O)，132.1(C-1，2)，131.1(C-3，6)，128.5(C-4，5)，68.0(C-1'，l'')，38.2(C-2'，2'')，30.2(C-3'，3'')，27.8(C-4'，4'')，29.8(C-5'，5'')，29.3(C-6'，6'')，31.8(C-7'，7'')，22.7(C-8'，8'')，14.0(C-9'，9'')，23.7(C-a'，a'')，11.9(C-b'，b'')。上述氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］一致，故鑒定化合物7為鄰苯二甲酸二(2-乙基)壬酯。

化合物8 無色油狀物，分子式C32H54O4;EIMS m/z 502.4 ［M］+。1H NNR(600 MHz，CDCl3)δ:7.64(2H，dd，J=6.0，3.5 Hz，H-3，6)，7.67(2H，dd，J=6.0，3.5 Hz，H-4，5)，4.20(4H，m，H-1'，l'')，1.70(2H，m，H-2'，2'')，1.42(28H，m，H-3'，3''，4'，4''，5'，5''，6'，6''，8'，8''，9'，9''，a'，a'')，0.85(6H，t，J=4.5 Hz，H-10'，10'')，0.90(6H，t，J=4.5 Hz，H-b'，b'');13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:132.1(C-1，2)，131.1(C-3，6)，128.5(C-4，5)，168.1(C=O)，68.0(C-1'，l'')，38.2(C-2'，2'')，30.2(C-3'，3'')，27.8(C-4'，4'')，29.8(C-5'，5'')，29.3(C-6'，6'')，31.8(C-7'，7'')，22.7(C-8'，8'')，23.0(C-9'，9'')，14.7(C-10'，10'')，23.1(C-a'，a'')，12.3(C-b'，b'')。上述氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］一致，故鑒定化合物8為鄰苯二甲酸二(2-乙基)癸酯。

3 抗污損生物附著活性及構(gòu)效關(guān)系研究

藤壺(Balanus)屬于甲殼綱藤壺科動物。藤壺幼蟲從母體脫離開后，隨后洋流漂浮，遇到人類建筑物如碼頭、船底、核電站排水口后就會附著其上，很難被清除，嚴(yán)重影響人類生產(chǎn)生活安全和造成經(jīng)濟(jì)損失，是一種典型的海洋污損生物。通過測試鄰苯二甲酸酯類化合物1～8抗藤壺幼蟲附著活性發(fā)現(xiàn)，化合物1～8都顯示出具有抗海洋污損生物藤壺幼蟲附著活性，EC50(半最大效應(yīng)濃度)值均低于美國海軍研究中心認(rèn)定能做海洋抗污損劑最低要求(25 μg/mL)，且LC50(半致死濃度)也均高于100(μg/mL)。

表1 鄰苯二甲酸酯類化合物抗藤壺幼蟲附著活性Table 1 Anti-larval settlement activity of PAEs using the barnacle Balanus amphitrite

對照測試化合物1～8的結(jié)構(gòu)共同點，再與之前測試已報道化合物活性［6，14，15］對比，可知酯結(jié)構(gòu)單元與抗海洋污損生物附著活性密切相關(guān)，其他類型活性測試也存在該結(jié)論［16，17］。原因為當(dāng)含有酯結(jié)構(gòu)單元時，化合物通過擴(kuò)散效應(yīng)比較容易穿透細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此也更容易顯示出活性［16］?；衔?～8中脂肪鏈長短，對其抗海洋污損生物附著活性有顯著影響。表1中表明，鄰苯二甲酸酯類化合物脂肪鏈越長，抗海洋污損生物附著能力越強(qiáng)，如化合物8的脂肪鏈有10個碳，而化合物5只有3個碳，前者抗藤壺幼蟲附著活性是后者10倍。有文獻(xiàn)［14］報道說長脂肪鏈可使酯類化合物更加容易接觸到作用部位。脂肪側(cè)鏈中支鏈對化合物1～8也有一定的影響，從其抗藤壺幼蟲附著活性結(jié)果可知，存在脂肪支鏈比沒有支鏈活性強(qiáng)，脂肪支鏈長比短活性強(qiáng)。推測原因是脂肪側(cè)鏈中存在支鏈可以增加鄰苯二甲酸酯類化合物的脂溶性，從而增加其擴(kuò)散效應(yīng)，達(dá)到與存在酯結(jié)構(gòu)單元相同的目的。

4 結(jié)論

通過各種分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)鑒定方法，從柳珊瑚Anthogorgia caerulea、枯草芽孢桿菌和真菌Cladosporium sp.發(fā)酵液中共分離鑒定了8個鄰苯二甲酸酯類化合物。采用典型海洋污損生物藤壺的幼蟲，測試了獲得8個化合物抗海洋污損生物附著能力，發(fā)現(xiàn)化合物1～8均顯示出具有開發(fā)成海洋抗污劑的潛力(EC50＜25 μg/mL)。研究鄰苯二甲酸酯類化合物的構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)，該類化合物含有的脂類結(jié)構(gòu)、脂肪側(cè)鏈和脂肪側(cè)鏈中支鏈均影響該類化合物的抗海洋污損生物附著能力。

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