張清安，范學(xué)輝，劉 梅，張志琪

1陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院;2陜西師范大學(xué)體育學(xué)院;3陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，西安 710062

沙苑子(Semen Astragali Complanati)為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatus R.Br.)干燥成熟的種子，在歷代本草中曾以大沙苑、蔓黃芪等名稱入藥［1］;由于含有豐富的酚類、萜類、多糖、鐵、鋅等功能成分，使其成為開發(fā)功能食品的良好原料。對于沙苑子的研究主要集中在藥理作用［2］和化學(xué)成分方面［3］。而對于沙苑子中黃酮類物質(zhì)的提取，除了作者所在課題組已開展過相關(guān)研究外［4，5］，龐來祥［6］、于猛［7］、劉銀芳［8］和李洪娟［9］等也分別采用乙醇溶液為提取劑、或采用正交設(shè)計或超聲輔助手段研究了沙苑子總黃酮的提取工藝;但尚未見到采用甲醇為提取溶劑、響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取工藝并對提取物清除DPPH自由基能力進行研究的報道。

鑒于不同的提取溶劑和方法會直接影響提取物的成分、含量和活性，因此本文在提取溫度、時間、料液比、原料粒度大小及溶劑濃度等單因素實驗基礎(chǔ)上，直接以提取物吸光度(采用提取物溶液的吸光度作比較可以簡化實驗步驟、減少原料及試劑用量)為評價指標，采用響應(yīng)面分析法對沙苑子中黃酮類化合物的超聲輔助提取工藝進行了優(yōu)化;并在此基礎(chǔ)上研究了提取物對DPPH自由基的清除能力，以期為有效利用和開發(fā)沙苑子提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與儀器

1.1 主要設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;KQ3200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;JA2003N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司;Alphal-4真空冷凍干燥機，德國christ公司;FW400A高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 原料與試劑

沙苑子:購于西安市西北藥材市場，經(jīng)王炳利教授鑒定為為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatus R.Br.)干燥成熟的種子。取適量沙苑子經(jīng)粉碎后，分別過 20、40、60、80、100、120、140、160 目篩子，將所得沙苑子粉用石油醚回流8 h脫脂后晾干備用。

甲醇、石油醚購自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;DPPH(二苯代苦味酰肼基自由基)購自Sigma公司。

2 實驗方法

2.1 最佳吸收波長及溶劑極性對提取率的影響

分別精確稱取140目沙苑子粉11份各1.000 g于三角瓶中，再分別對應(yīng)加入體積分數(shù)為100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%和0%的甲醇提取溶液30 mL，封口膜密封后在50℃條件下超聲(超聲功率120 W，頻率40 kHz，下同)30 min，過濾定并容至50 mL，從中吸取1 mL濾液再定容至10 mL，進行掃描(550 nm～190 nm)，并測定最大吸收波長處的吸光度。

2.2 吸光度與沙苑子黃酮類提取物濃度間的換算關(guān)系

稱取一定數(shù)量的沙苑子粉用60%甲醇溶液提取，濾液于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮后冷凍干燥，備用。

稱取一定量凍干物，用60%甲醇在超聲作用下充分溶解并定容，再將其稀釋配成一系列體積分數(shù)的待測溶液，在2.1所確定最大吸收波長處測定吸光度，將吸光度y與黃酮類提取物濃度x(mg/mL)進行線性回歸得:Y=4．4219X+0．0448，相關(guān)系數(shù)R2為0.9902。因此，在以下面試驗中僅以吸光度就可以快速比較沙苑子黃酮的提取率。

2.3 單因素試驗

2.3.1 粒度大小

分別準確稱取 20、40、60、80、100、120、140、160目沙苑子粉1.000 g于三角瓶中，并分別加入一定體積甲醇提取溶劑超聲30 min，后將提取液過濾定容。取樣并于2.1所確定吸收波長處測定吸光度。

2.3.2 液料比、提取溫度和提取時間

按照上述操作方法，分別研究甲醇提取液為10、15、20、25、30、35、40、45 mL(提取溫度和時間固定);或提取溫度分別為 20、30、40、50、60、70、80 ℃(提取時間和料液比固定);或提取時間分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90 min(料液比和溫度固定)時對黃酮類物質(zhì)提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)

綜合前面單因素試驗所得結(jié)果，選取對沙苑子黃酮提取液吸光度有較大影響的四個因素為研究參數(shù)，并以提取液吸光度為響應(yīng)值(指標值)，做四因素三水平BBD優(yōu)化試驗。響應(yīng)面分析所用二次多項式公式為:

β0、βi、βii、βij分別代表常數(shù)項、一次項、二次項及交互項的系數(shù)，xi和xj代表獨立變量。實驗所得響應(yīng)值用 Design-Expert7.1.3 Trial(State-Ease，Inc.，Minneapolis MN，USA)軟件進行處理以獲得二次項模型，并對擬合模型進行統(tǒng)計學(xué)檢驗分析。

2.5 沙苑子黃酮類提取物對DPPH自由基的清除能力

2.5.1 反應(yīng)時間的確定

將優(yōu)化條件下提取物配制成一定濃度溶液，取0.10 mL待測液加入3.90 mL濃度為10-4mol/L DPPH由自基甲醇溶液中，迅速搖勻后在515 nm條件下對其進行時間掃描，以確定合適的反應(yīng)時間。

2.5.2 反應(yīng)中加入提取物濃度的確定和清除DPPH自由基能力測定

分別取各濃度待測樣品溶液0.10 mL加入3.90 mL DPPH自由基溶液中，迅速搖勻并于室溫下反應(yīng)30 min，測定其在515 nm下的吸光度以計算對DPPH的清除率。清除率按下面公式計算:

式中:As為反應(yīng)物加入DPPH中30 min后體系的吸光度;

A0為0 min時DPPH溶液自身的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 吸收波長及溶劑極性對提取率的影響

由圖1(a)～(b)沙苑子甲醇提取液掃描曲線可以看出，提取液在350 nm、266 nm和219 nm左右處均有吸收峰和重現(xiàn)性，但考慮到266 nm是沙苑子黃酮類物質(zhì)的特定吸收波長［10］，所以選擇266 nm作為沙苑子甲醇提取液的最佳測定波長。

圖1 沙苑子黃酮類化合物甲醇提取液全波長掃描曲線圖(a)和三次平行掃描三維圖(b)Fig.1 Full scan UV spectrum(a)and three-dimension combined UV spectrum(b)of methanol extracts

圖2 甲醇濃度對沙苑子黃酮類提取率的影響圖(a)和全波長掃描組合圖(b)Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction yield(a)and overlaid UV spectra(b)

由圖2(a)可以看出，甲醇濃度為30%時沙苑子黃酮類化合物提取液吸光度最大，之后吸光度逐漸下降。雖然30%甲醇提取液吸光度最大，但提取液渾濁、雜質(zhì)(糖類、蛋白質(zhì)等)含量也較高，造成假吸收現(xiàn)象，同時也會給過濾帶來困難;所以綜合考慮選用60%甲醇作為提取溶劑。由圖2(b)可以看出，提取液的吸收波長并未隨溶劑極性改變而發(fā)生大的轉(zhuǎn)移，說明用吸光值衡量提取率是可行的。

3.2 單因素實驗結(jié)果

3.2.1 粒度大小對沙苑子黃酮類化合物提取率的影響

圖3 粒度大小對沙苑子黃酮類化合物提取率的影響Fig.3 Effect of particle size on extraction yield of flavones

由圖3可知，隨著沙苑子粉粒度減小(目數(shù)增大)，甲醇提取液吸光度也隨著增大，主要原因是粒度越小與提取溶劑接觸越充分。但考慮到粒度太小，提取液混濁、非目標提取物增多且不易過濾，所以選取沙苑子粒度為40、80、120目為響應(yīng)面分析用的三個水平值。

3.2.2 提取溫度對沙苑子黃酮類化合物提取率的影響

從圖4可以看出，溫度從20℃升高到50℃過程中沙苑子提取液的吸光度也隨之升高，但超過50℃后增加不明顯且有下降趨勢(80℃時有所增高，原因不明)，而且溫度過高也不易操作控制，綜合考慮響應(yīng)面分析時選30、40、50℃為三個溫度水平。

圖4 提取溫度對沙苑子黃酮類化合物提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of flavones

3.2.3 提取時間對沙苑子黃酮類化合物提取率的影響

由圖5可知隨著提取時間的延長，提取液吸光度也逐漸增大，但超過50 min后增加幅度不大，考慮到超聲時間過長可能會造成化學(xué)破壞效應(yīng)而且不利于節(jié)能，所以選取30、40、50 min為響應(yīng)面優(yōu)化的三個水平。

3.2.4 液料比對沙苑子黃酮類化合物提取率的影響

圖5 提取時間對沙苑子黃酮類化合物提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of flavones

圖6 液料比對沙苑子黃酮類化合物提取率的影響Fig.6 Effect of solvent-to-sample ratio on extraction yield of flavones

由圖6可知，在液料比為10∶1到25∶1之間時，吸光度逐漸增大，在25∶1～50∶1之間時有所下降但不明顯;雖然適當增大液料比有利于提取，但會加大溶劑回收的工作量，所以響應(yīng)面分析時液料比水平范圍選為 20∶1、25∶1、30∶1。

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化沙苑子黃酮類化合物的提取工藝

3.3.1 響應(yīng)面分析因素的選取及分析方案

表1和表2分別為根據(jù)單因素試驗結(jié)果所確定的各因素水平范圍、編碼和響應(yīng)面分析方案及結(jié)果。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平及編碼表Table 1 Levels and factors for response surface methodology

表2 響應(yīng)面分析方案和實驗結(jié)果表Table 2 Design and results for response surface methodology

2 1 0 0 1 0.802 3 0 1 0 1 1.012 4 1 0-1 0 0.784 5 0 0-1 1 1.011 6 0 0 1-1 0.856 7-1 0 0 -1 0.681 8 0 0 0 0 0.910 9 0 0 0 0 0.933 10 -1 0 -1 0 0.686 11 0 0 1 1 0.981 12 -1 -1 0 0 0.655 13 1 0 1 0 0.856 14 -1 1 0 0 0.546 15 0 -1 0 1 0.886 16 0 0 0 0 0.922 17 0 -1 0 -1 0.755 18 0 0 -1 -1 0.755 19 0 1 1 0 0.954 20 1 1 0 0 0.605 21 0 1 -1 0 0.627 22 1 0 0 -1 0.551 23 0 0 0 0 0.923 24 -1 0 0 1 0.719 25 0 0 0 0 0.928 26 -1 0 1 0 0.856 27 0 0 0 0 0.926 28 0 0 0 0 0.929 29 0 -1 -1 0 0.792 30 1 -1 0 0 0.582 31 0 -1 1 0 0.737

3.3.2 響應(yīng)面二次回歸模型建立及分析

由表 3 可看出，β3、β4、β11、β22和 β23分別在 P ＜0.01或P＜0.05水平上顯著，說明他們對應(yīng)的變量對響應(yīng)值(或回歸模型)有極顯著或顯著影響;而其它變量影響不顯著(P＞0.05)。經(jīng)回歸擬合的多項式模型為:

Y=0.92+0.003083X1+0.000167X2+0.049X3+0.096X4+0.033X1X2-0.025X1X3+0.053X1X4+0.096X2X3+0.054X2X4-0.033X3X4-0.19+0.12+0.009911-0.018

由表3還可看出，模型P＜0.0001，相關(guān)系數(shù)R2=0.9247，調(diào)整系數(shù)R2=0.8588，表明模型能充分反映所選變量之間的關(guān)系，測定值和預(yù)測值間有良好的相關(guān)度。6.61%的變異系數(shù)說明模型具有良好的重現(xiàn)性，可以將該擬合模型用于優(yōu)化甲醇提取沙苑子黃酮類的工藝參數(shù)。

表3 回歸模型方差分析和顯著性檢驗Table 3 Estimated regression coefficients and analysis of variance(ANOVA)for the model

β1 3.083E-003 0.015 1 1.141E-004 0.041 0.8426 β2 1.667E-004 0.015 1 3.333E-007 1.919E-004 0.9914 β3 0.049 0.015 1 0.029 10.19 0.0057 β4 0.096 0.015 1 0.11 39.23 ＜0.0001二次項系數(shù)Quadratic β11 -0.19 0.020 1 0.25 88.91 ＜0.0001 β22 -0.12 0.020 1 0.11 39.88 ＜0.0001 β33 -9.911E-003 0.020 1 7.022E-004 0.25 0.6233 β44 -0.018 0.020 1 2.243E-003 0.80 0.3840交互項系數(shù)Interaction β12 0.033 0.026 1 4.356E-003 1.56 0.2302 β13 -0.025 0.026 1 2.401E-003 0.86 0.3682 β14 0.053 0.026 1 0.011 4.05 0.0613 β23 0.096 0.026 1 0.036 13.03 0.0023 β24 0.054 0.026 1 0.012 4.17 0.0581 β34 -0.033 0.026 1 4.290E-003 1.53 0.2336模型 Model 14 0.039 14.03 ＜0.0001純誤差Pure Error 6 5.429E-005 R2 0.9247 校正R2 0.8588 C.V.% 6.61 預(yù)測參差平方和PRESS 0.26精密度Adequate precision 12.335

3.3.3 沙苑子黃酮類化合物提取工藝條件的確定

對回歸方程求偏導(dǎo)數(shù)，解四元一次方程組，得出4個變量的最優(yōu)試驗點(X1、X2、X3、X4)的水平代碼值分別為 0.137、0.644、1.000、1.000，通過水平轉(zhuǎn)換公式，得出實際最優(yōu)工藝參數(shù)為提取溫度為X1=41.37℃，提取時間X2=46.44 min，液料比為X3=30∶1，沙苑子粒度X4=120目。根據(jù)實際將工藝參數(shù)調(diào)整為 42 ℃、47 min、30∶1、120 目。按此優(yōu)化條件進行3次平行實驗結(jié)果吸光度為0.9879 ±0.0003(n=3)，與模型預(yù)測值1.0745間沒有顯著差異，說明優(yōu)化模型及結(jié)果可靠。經(jīng)轉(zhuǎn)換1 g沙苑子用60%甲醇提取可得106.64 mg黃酮類提取物，提取率為 10.66% 。與同類文獻報道相比［6，8，9］，本實驗提取率為最高。

圖7 甲醇提取物清除DPPH自由基的時間掃描圖Fig.7 Absorption evolution of DPPH reacted with methanol extracts

3.4 提取物清除DPPH自由基實驗結(jié)果

圖8 不同濃度提取物對DPPH自由基的清除率Fig.8 DPPH scavenging ratio of different concentrations of methanol extracts

DPPH是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，其醇溶液呈紫色，在515 nm處有強吸收，當還原性物質(zhì)加入DPPH自由基中時，其吸光度變小，因而可用對DPPH的清除率簡便、準確評價還原性物質(zhì)的抗氧化能力;但不同文獻中對該方法比色條件的選擇差異較大，因此本實驗對反應(yīng)時間進行了研究。由圖7可知，提取物加入DPPH溶液中后，前15 min左右其吸光度下降非常迅速(從最初1.012下降到0.138)，反應(yīng)30 min后基本趨于穩(wěn)定，因此本實驗采用30 min作為反應(yīng)測定時間。

由圖8可以看出，在低濃度情況下(低于2.0%)，提取物濃度與自由基清除率呈正相關(guān)，且提取物濃度為2.00%時清除率最高，為91.20%;當濃度大于2.50%時，隨著濃度的升高清除率卻有所下降，可能原因是反應(yīng)體系中自由基已被耗盡而提取物仍有剩余，而提取物本身在515 nm處也有一定吸收所致。因此，測定沙苑子甲醇提取物對DPPH自由基清除效果時，提取物濃度在2.00%以內(nèi)較為合適。

4 結(jié)論

沙苑子甲醇提取物在266 nm處有最大吸光值;各因素對沙苑子黃酮類物質(zhì)提取率的影響依次為沙苑子粒度、料液比、提取溫度和時間。響應(yīng)面法優(yōu)化后的超聲輔助提取沙苑子黃酮的工藝參數(shù)為:60%甲醇、42℃、47 min、液料比30∶1和120目。按此優(yōu)化條件進行3次平行實驗結(jié)果為0.9879±0.0003(n=3)，與模型預(yù)測值1.0745間沒有顯著差異，說明優(yōu)化模型及結(jié)果可靠，提取率為10.66%。沙苑子甲醇提取物具有一定的清除DPPH自由基效果，低濃度條件下呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，濃度為2%時清除率最高。

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