寧 娛，張 潤(rùn)，鄒子軍，孫 洋，陳杰桃，林朝展*，熊天琴，祝晨蔯*

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣州 501045;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006

齊墩果烷型和熊果烷型五環(huán)三萜類化合物是廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，近年來(lái)的研究表明，該兩類成分具有較好的抗肝損傷活性［1，2］，可通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞再生，使壞死區(qū)迅速修復(fù)、降低肝組織炎癥反應(yīng)、抑制膠原纖維增生等途徑，從而發(fā)揮保肝作用。目前已有齊墩果酸、甘草甜素等作為保肝藥物在臨床上分別用于急性黃疸型肝炎和病毒性肝炎的治療。因此，植物來(lái)源的三萜類化合物在開(kāi)發(fā)保肝新藥方面顯示了巨大的潛在優(yōu)勢(shì)。

已有文獻(xiàn)研究報(bào)道，紫珠屬(Callicarpa)、香茶菜屬(Isodon)植物中多含有三萜類成分［3，4］，而本課題組長(zhǎng)期對(duì)上述2屬的3種廣東地區(qū)習(xí)用藥材枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜中五環(huán)三萜化合物進(jìn)行系統(tǒng)的分離鑒定研究，得到32個(gè)五環(huán)三萜類化合物［5，6］，采用葡萄糖氧化酶GO造氧化肝損傷細(xì)胞模型，檢測(cè)五環(huán)三萜類單體化合物對(duì)肝損傷細(xì)胞的保護(hù)活性，同時(shí)利用目前最常用的3D-QSAR方法——比較分子力場(chǎng)分析(Comparative Molecular Field Analysis，CoMFA)［7，8］研究三萜類化合物分子結(jié)構(gòu)參數(shù)與氧化肝損傷細(xì)胞保護(hù)活性之間的三維定量關(guān)系，并建立相應(yīng)的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系模型，以期為深入研究其保護(hù)機(jī)制、設(shè)計(jì)高活性保肝藥提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

熔點(diǎn)用X6顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定(北京泰克儀器有限公司);NMR用AVANCE AV 400超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker)測(cè)定;TMS內(nèi)標(biāo);MS用Agilent QQQ 1260-6460(液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)，Agilent公司(美國(guó))。柱層析硅膠和薄層層析硅膠(青島海洋化工廠);所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(廣州化學(xué)試劑廠);反相硅膠:RP-C18(40～63 μm)。氘代試劑:吡啶(NORELL，USA)，甲醇和氯仿(Cambridge Isotope Laboratories，USA)。

實(shí)驗(yàn)所用枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜分別采自從化國(guó)家森林公園、海南臨高裸花紫珠種植基地和清遠(yuǎn)狹基線紋香茶菜GAP種植基地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室潘超美教授鑒定學(xué)名為馬鞭草科(Verbenaceae)紫珠屬(Callicarpa L.)植物枇杷葉紫珠(C．konchiana Makino)、裸花紫珠(C．nudiflora Hook.et Arn)和唇形科(Labiatae)香茶菜屬(Isodon)植物狹基線紋香茶菜(I．lophanthoides var．gerardianus)，憑證標(biāo)本現(xiàn)保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥物分析研究室(憑證標(biāo)本:No.CKM071005;CNF081003;ILG080916)，晾干，粉碎成粗粉，備用。

2 提取與分離

取枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜粗粉各10.0 kg，分別用甲醇(150～200 L)進(jìn)行滲漉提取，將提取液減壓濃縮。將濃縮液混懸于6.0～10.0 L蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，將萃取液分別進(jìn)行減壓濃縮得到各部位浸膏。每個(gè)乙酸乙酯部位運(yùn)用硅膠柱色譜法進(jìn)行分離，用氯仿-甲醇梯度洗脫，適當(dāng)合并為若干個(gè)流份。根據(jù)流份的具體情況，再選用重結(jié)晶、硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜等方法反復(fù)分離純化。分別得到五環(huán)三萜化合物1～32，純度經(jīng)過(guò)HPLC面積歸一化法測(cè)定，均大于99%。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

本研究從枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜三種藥用植物中總共分離得到32個(gè)三萜類化合物(見(jiàn)表1和表2)，該類成分大部分為三萜苷元，共有25個(gè)，只有7個(gè)以苷的形式存，分離的三萜類化合物分別屬于齊墩果烷型(10個(gè)):齊墩果酸(oleanolic aicd，1)、2α，3β，23-三羥基齊墩果烷-12烯-28-酸-O-β-葡萄 糖 酯 (2α，3β，23-trihydroxy-12-ene-28-oic-O-β-D-glucopyranoside，2)、2α，3β-二羥基-12-烯-28-齊墩 果 酸 (2α，3β-dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid，3)、2α，3β，23-三羥基-12-烯-28-齊墩果酸(hyptatic acid，4)、2α，3β，19α，23-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸(2α，3β，19α，23-tetrahydroxy-12-ene-28-oic-acid，5)、2α，3β，23，29-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸(stachlic acid A，6)、常春藤皂苷元(hederagenin，7)、3-乙酰齊墩果酸(3-acetyl oleanolic acid，8)、2α，3β，19α，23-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖酯 (2α，3β，19α，23-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-Dglucopyranoside，9)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香樹(shù)脂醇苷(α-amyrin-3-O-β-D-glucopyranosides，10);熊果烷型(22個(gè)):3β-乙酰氧基熊果烷-12-烯-28醇(3β-acetoxy-28-hydroxyurs-12-ene，11)、α-香樹(shù)脂醇乙酸乙酯(α-amyrin acetate，12)、3β-乙酰氧基-12-烯-28 熊果酸(3β-acetoxy-28-oic acid-12-ene，13)、3β，19α-二羥基-12 烯-28 熊果酸(3β，19α-dihydroxyurs-12-ene-28-oic acid，14)、3β，19α-二羥基熊果烷-12 烯-24，28-二 醇 (3β，19α-dihydroxy-24，28-hydroxyurs-urs-12-ene，15)、2α，3β，19α-三羥基熊果烷-12 烯-24，28-二酸(2α，3β，19α-trihydroxy-urs-12-ene-23，28-dioic acid，16)、3-O-β-L-阿拉伯糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-甲酯(3-O-β-L-arabinopyranosyl-19α-hydroxy-urs-12-ene-28-O-acid methylester，17)、3-O-β-D-木糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-O-β-D-葡萄糖酯 (3-O-β-D-xylpyranosyl-19α-dihydroxyurs-12-ene-28-O-β-D-glycopranoside，18)、2α，3-O-β-D-葡萄糖醛酸-19α-羥基-12 烯-28-熊果酸(2α，3-O-β-D-glucuronide-19α-dihydroxyurs-12-ene-28-oic acid，19)、3-β-O-α-L-阿拉伯糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-β-D-葡 萄 糖 酯 (3-β-O-α-L-arabinopyranosyl-19αhydroxy-urs-12-ene-28-β-D-glucopyranoside oic acid，20)、2β，3β，19α-三羥基熊果酸(2β，3β，19α-trihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，21)、熊果酸 (ursolic acid，22)、2α，3β，19，23-四羥基-12 烯-28-熊果酸(myrianthic acid，23)、坡模酸(pomolic acid，24)、2α，19α-二羥基熊果酸(2α，19α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，25)、2β-羥基熊果酸 (2α-hydroxy-12-ene-28-ursolic acid，26)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香樹(shù)脂醇苷(α-amyrin-3-O-β-D-glucopyranoside，27)、α-香樹(shù)脂醇(α-amyrin，28)、2α，3α-二羥基熊果酸(2α，3α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，29)、2α，19α-二羥基熊果酸 (2α，19α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，30)、2α，3β，19，24-四羥基-12-烯-28-熊果酸(2α，3β，19，24-tetrahydroxy-12-ene-28-oic acid，31)、2α-O-乙酰熊果酸(2α-O-acetyl ursolic acid，32)。

4 三萜類成分體外抗肝損傷活性研究

對(duì)上述分離得到的齊墩果烷型及熊果烷型五環(huán)三萜成分，采用葡萄糖氧化酶GO體外致肝損傷模型進(jìn)行保肝作用觀察。

根據(jù)32個(gè)藥物的溶解性，選用相應(yīng)的溶劑，制備成1000 μg/mL的母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋成濃度為 1、10、50、100 μg/mL 的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。取凍存的L02細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速搖溶，在超凈工作臺(tái)中，移入離心管中，并加入新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640，吹打成細(xì)胞懸液，1000 rpm離心3 min，棄上清，細(xì)胞沉淀加入新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640，吹打成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，放于5%CO2、濕度95%、37℃條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)培養(yǎng)瓶底面積分?jǐn)?shù)80% ～90%融合后用PBS洗滌1次，加入0.25%的胰酶適度消化，再加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，吹打成細(xì)胞懸液。1000 rpm離心3 min，棄上清，按1∶3比例傳代。正常細(xì)胞對(duì)照組、正常細(xì)胞模型組、0.1%生理鹽水溶劑對(duì)照組、0.1%生理鹽水溶劑模型組、0.1%DMSO溶劑對(duì)照組、0.1%DMSO溶劑模型組、32個(gè)藥物組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)好的L02細(xì)胞，用0.25%的胰酶適度消化，用新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h之后，吸出舊培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的 RPMI-1640，進(jìn)行同步化。24 h之后加入相應(yīng)的各組含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，模型組及藥物組加入葡萄糖氧化酶GO(終濃度為100 mU/mL)造成氧化應(yīng)激模型。于GO作用4 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，振蕩10min，溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀上490 nm處測(cè)定各孔的吸光值(A)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常細(xì)胞對(duì)照組比較，0.1生理鹽水溶劑對(duì)照組及0.1 DMSO溶劑對(duì)照組的吸光值沒(méi)有差異。與對(duì)照組比較，相應(yīng)的模型組的吸光值均顯著降低(P＜0.01)。與0.1%生理鹽水溶劑模型組比較，Urosanetype三萜較Oleane-type三萜的保肝活性明顯增強(qiáng)，多羥基取代都使得化合物的保肝活性顯著升高。

圖1 齊墩果烷母核Fig.1 Chemical structures of Oleane-type triterpenoids

表1 齊墩果烷型三萜類化合物Table 1 Structure，experimental and calculated activity values of Oleane-type triterpenoids

5 OH OH CH2OH CH3 OH CH3 COOH H 1.258 0.099 0.239 -0.140 6 OH OH CH3 CH2OH H CH2OH COOH H 2.365 0.374 0.341 0.033 7 H OH CH2OH CH3 H CH3 COOH H 35.522 1.550 1.646 -0.096 8 H OCOCH3 CH3 CH3 H CH3 COOH H 64.35 1.808 1.798 0.010 9 OH OH CH3 CH2OH OH CH3 COOGlu OH 56.332 1.751 1.675 0.076 10 H O-Glu CH3 CH3 H CH3H H ＞100 2.000 1.992 0.088

圖2 熊果烷母核Fig.2 Chemical structures of Urosane-type triterpenoids

表2 熊果烷型三萜類化合物結(jié)構(gòu)、活性數(shù)據(jù)及預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 Structure，experimental and calculated activity values of Urosane-type triterpenoids

5 三萜類成分三維定量構(gòu)效關(guān)系的研究

本文采用Tripos公司的SYBYL 1.3分子模擬軟件包完成所有分子模型構(gòu)建和統(tǒng)計(jì)分析工作。如無(wú)特殊說(shuō)明，所選參數(shù)均為默認(rèn)值。本文研究的32個(gè)三萜類化合物的保肝活性數(shù)據(jù)(IC50)來(lái)源于體外保肝實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1，活性數(shù)據(jù)形式經(jīng)過(guò)負(fù)對(duì)數(shù)變換(pIC50=-lgIC50)，這種變換不影響模型的內(nèi)在規(guī)律。隨機(jī)選擇4個(gè)化合物作為測(cè)試集，用來(lái)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)能力，其余化合物為訓(xùn)練集。

第一步，活性構(gòu)象確定。由于CoMFA研究涉及到化合物分子的三維結(jié)構(gòu)，因此確定活性構(gòu)象是CoMFA研究的關(guān)鍵步驟。先用sybyl x1.3軟件中sketch molecule構(gòu)建化合物，然后以分子力學(xué)程序Minimize進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，優(yōu)化過(guò)程中采用Powell能量梯度法、Tripos力場(chǎng)、Gasteiger-Hckel電荷，迭代1000次，能量收斂限定為0.005 kj/mol，得到優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)，建立分子庫(kù)。

第二步，分子疊合。是CoMFA方法中的關(guān)鍵一步，對(duì)于所建立的三維構(gòu)效關(guān)系模型質(zhì)量有重要影響。當(dāng)活性構(gòu)象確定后，一般根據(jù)一定的規(guī)則，如藥效團(tuán)、力場(chǎng)、公共骨架等進(jìn)行分子疊合，使每個(gè)分子采用具有最大力場(chǎng)相似性的空間取向進(jìn)行計(jì)算。本研究選擇活性最好的化合物31為模板分子，用A-lign Database進(jìn)行骨架疊合，見(jiàn)圖3。

第三步，CoMFA模型的構(gòu)建。將重疊好的分子置于自動(dòng)生成的三維網(wǎng)格中，網(wǎng)格包含所有分子，并且在 X、Y、Z軸方向至少延伸0.4 nm。用一個(gè)sp3雜化的正碳原子探測(cè)每個(gè)格點(diǎn)上的立體場(chǎng)與靜電場(chǎng)能，利用偏最小二乘法(PLS)建立模型，首先用SAMPLS方法做LOO(Leave-one-out)交叉驗(yàn)證，得到最佳主成分?jǐn)?shù)和交叉驗(yàn)證系數(shù)q2。然后在最佳主成分?jǐn)?shù)下做非交叉驗(yàn)證，建立相應(yīng)的CoMFA模型。隨后，采用SteDev* Coeff方法顯示三維等值圖，直觀地反映出立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)對(duì)活性的影響。

圖3 化合物的分子疊合圖Fig.3 Superimposition map of compounds

6 結(jié)果與討論

本文以28個(gè)化合物為訓(xùn)練集，在自動(dòng)生成的網(wǎng)格上，以sp3雜化的正碳原子為探針，計(jì)算分子在每個(gè)格點(diǎn)上的立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)(相應(yīng)的立體作用能與靜電作用能的閾值均用默認(rèn)值)，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)q2為0.719，最佳主成分?jǐn)?shù)為6;由最佳主成分?jǐn)?shù)進(jìn)行非交叉驗(yàn)證得到常規(guī)相關(guān)系數(shù)γ2為0.976;標(biāo)準(zhǔn)方差(SEE)為0.124，數(shù)據(jù)組之間的平均平方誤差與數(shù)據(jù)組內(nèi)部的平均平方誤差的比值(F)為142.001，立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)的貢獻(xiàn)值分別為86.7%%和13.3%，表明空間效應(yīng)是主要的影響因素。一般認(rèn)為，q2大于0.5時(shí)，所得模型具有可信的預(yù)報(bào)能力，非交叉驗(yàn)證的常規(guī)相關(guān)系數(shù)大于0.9時(shí)，表明模型有很好的自身一致性。本模型 q2達(dá)到0.719，γ2達(dá)到0.976，說(shuō)明該模型具有較好的預(yù)測(cè)能力和自身一致性。由CoMFA模型預(yù)測(cè)的各化合物活性及其與實(shí)驗(yàn)值的殘差見(jiàn)表1。預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)分析圖見(jiàn)圖4。

圖4 CoMFA模型預(yù)測(cè)活性與實(shí)驗(yàn)活性之間的關(guān)系Fig.4 Predicted and experimental pIC50for the CoMFA model

圖5為較為理想的CoMFA模型三維等值圖，從疊合分子周圍空間可看出化合物的各種不同場(chǎng)對(duì)活性的影響。立體場(chǎng)分布圖(5A)中，在綠色區(qū)域引入大體積取代基或在黃色區(qū)域減小取代基的體積有利于化合物活性的提高，靜電場(chǎng)分布圖(5B)中，在藍(lán)色區(qū)域引入正電性基團(tuán)或在其紅色區(qū)域引入負(fù)點(diǎn)性較大的基團(tuán)將有利于化合物活性增加，分析可得Urosane-type三萜較Oleane-type三萜的保肝活性明顯增強(qiáng);在3、19、20、23和24等5個(gè)取代位置添加帶負(fù)電荷的基團(tuán)如-OH，則使化合物的保肝活性明顯提高;如在這些位置引入疏水性較強(qiáng)的基團(tuán)如-CH3等，則可能使化合物的保肝活性降低。在19和23兩個(gè)位置上接入-OH化合物比其他位置接上-OH的化合物保肝活性明顯要好。該結(jié)論同藥理活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明本文所建立的CoMFA模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

綜上所述，本文對(duì)32個(gè)五環(huán)三萜類化合物進(jìn)行的3D-QSAR研究，構(gòu)建了一個(gè)預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)的CoMFA模型，其交叉驗(yàn)證系數(shù)q2為0.719，非交叉驗(yàn)證系數(shù)γ2為0.976，統(tǒng)計(jì)方差比F=142.001，影響藥效立體場(chǎng)的靜電場(chǎng)貢獻(xiàn)分別為86.7%%和13.3%，表明空間效應(yīng)是主要的影響因素。以上研究結(jié)果說(shuō)明Urosane-type三萜可以作為保肝藥的候選先導(dǎo)化合物，為后續(xù)深入進(jìn)行具有針對(duì)性的局部結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化提供較為理想的模板，有望開(kāi)發(fā)出具有更高保肝活性的化合物。

圖5 CoMFA模型等值圖Fig.5 Contour maps of the CoMFA model

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