付榮，李宗偉，趙超，單樹花，武海麗，袁琳潔，李卓玉

（山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006）

胰蛋白酶抑制劑（trypsin inhibitor，TI）是指具有胰蛋白酶抑制活性的多肽或蛋白質(zhì)，是一種重要的生化藥物和生化試劑［1］.胰蛋白酶抑制劑可以分為兩種類型：Bowman－Birk類和Kunitz類.豆科植物Bowman－Birk類胰蛋白酶抑制劑能夠抑制絲氨酸蛋白酶的活性，具促進(jìn)人類胃腸道健康的作用［2］.

創(chuàng)傷愈合是指遭受外力作用，組織出現(xiàn)離斷或缺損后的恢復(fù)過程，是以細(xì)胞增殖、遷移、肉芽組織形成、膠原分泌、組織重建為特點(diǎn)的過程.細(xì)胞遷移是創(chuàng)傷修復(fù)的第一階段.近年來，由于氧自由基在缺血性組織損傷的發(fā)病中具有重要作用，其介導(dǎo)的細(xì)胞損傷得到廣泛關(guān)注.巰基具有抗氧化作用［3］，可有效地消除自由基，從而抑制細(xì)胞凋亡.

綠豆胰蛋白酶抑制劑（MBTI）屬于Bowman－Birk類型抑制劑，含有賴氨酸和精氨酸兩個(gè)活性中心，分別位于Lys－Ser（20－21）和 Arg－Ser（47－48）［4］.目前，對 MBTI的研究多聚焦在 MBTI全長片段或Lys活性片段，而對精氨酸活性片段（MBTI－Arg）研究較少.精氨酸活性片段由27個(gè)氨基酸組成，其中包含7個(gè)Cys殘基，共含有三對二硫鍵和一個(gè)游離巰基.為了進(jìn)一步了解MBTI－Arg的生物學(xué)功能，本文用化學(xué)合成方法獲得該片段的編碼基因，通過原核表達(dá)、親和純化獲得目的蛋白片段.我們將該衍生物命名為Argc.并對Argc的蛋白酶抑制活性和其它生物學(xué)活性進(jìn)行了初步研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 E.coli DH5a、質(zhì)粒pGEX－4T－1均由本室保存.

1.1.2 細(xì)胞株 SW480，SW620，MDCK、HepG2、HL7702細(xì)胞株購自武漢博士德生物公司.

1.1.3 酶及主要生化試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、XhoI、T4DNA ligase、DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；RPMI－1640、DMEM培養(yǎng)基為Thermo公司產(chǎn)品；Protein Marker為上海生工生物公司產(chǎn)品；Glu－tathione Sepharose 4Fast Flow 為 GE Healthcare公司產(chǎn)品；BAPA（苯甲酰－dl－Arg－P－硝基酰替苯胺鹽酸鹽）為上海三杰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DTNB、MTT為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 方法

1.2.1 MBTI－Argc片段編碼基因的合成及重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－1－Argc的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)［5］報(bào)道的MBTI－Arg片段氨基酸序列，委托大連寶生物公司合成Argc片段的編碼基因（兩端插入BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)），經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切、膠回收目的基因片段，與同樣BamH I和XhoI雙酶切的pGEX－4T－1載體進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－1－Argc.雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒.

1.2.2 MBTI－Argc片段蛋白的表達(dá)及純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－1－Argc轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆，挑取單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后接種于1L的培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，收集菌體.用PBS緩沖液重懸菌體后超聲破碎，收集上清.采用GST親和層析法純化上清樣.將細(xì)菌裂解液上樣于該親和柱，隨后用PBS（pH7.4）緩沖液清洗親合柱，洗至紫外吸收值為0時(shí)停止洗滌.50mmol／L的 Tris－HCl（pH 8.0，10mmol／L的 GSH，）緩沖液洗脫，收集洗脫液，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度.

1.2.3 胰蛋白酶抑制劑活力測定

以BAPA（苯甲酰－dl－Arg－P－硝基酰替苯胺鹽酸鹽）為底物，在3mL緩沖液（100mmol／L Tris－HCl，10 mmol／L CaCl2）中依次加入濃度為0（100μL緩沖液）、0.15mg／mL、0.5mg／mL、0.7mg／mL、1.0mg／mL的GST－Argc各100μL和40μg胰蛋白酶；同時(shí)設(shè)置對照組，加入相同濃度的GST蛋白.37℃水浴5min，迅速加入底物BAPA 17μL（150mmol／L，溶于DMSO），繼續(xù)水浴10min后加入250μ體積分?jǐn)?shù)為33%的乙酸終止反應(yīng).由于胰蛋白酶可催化水解BAPA，引起410nm波長吸光值升高，加入胰蛋白酶抑制劑后會(huì)抑制該反應(yīng)，使吸光值減少，根據(jù)減少程度可表示抑制劑的抑制能力.

1.2.4 二硫鍵定量測定

自由巰基含量的測定方法見文獻(xiàn)［6］，CBB法檢測待測樣品的濃度，取200μL待測樣品，加入4.8g尿素定容至1mL，37℃溫浴4h.加入2mL Tris－Gly（86mmol／L Tris，90mmol／L glycine，4mmol／L EDTA）緩沖液，50μL DTNB（4mg／mL），5min后測定412nm吸光值.根據(jù)吸光值大小判斷多肽中游離巰基的含量.根據(jù)總巰基數(shù)計(jì)算二硫鍵個(gè)數(shù).

1.2.5 MTT法檢測對細(xì)胞增殖影響

指數(shù)生長期的SW480、SW620、MDCK及HepG2細(xì)胞以1×104個(gè)／孔傳入96孔培養(yǎng)板，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱37℃孵育24h后，加入不同濃度的融合蛋白至終濃度依次為2.0μmol／L、5.0μmol／L和10.0μmol／L.每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并用含相同濃度的GST蛋白的洗脫緩沖液作為對照.孵育24h后吸棄孔內(nèi)液體，PBS洗滌后加入新的培養(yǎng)基，每孔加MTT溶液（5mg／mL）20μL，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng).小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔490nm的光吸收值.

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將HL7702細(xì)胞以5×105～10×105個(gè)／孔密度接種到24孔板上.當(dāng)細(xì)胞貼壁并形成單層細(xì)胞后，用10 μL無菌移液槍槍頭垂直劃線，PBS洗滌，顯微鏡下測量劃痕直徑相同的兩孔分別設(shè)為實(shí)驗(yàn)組和對照組.實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5μmol／L的GST－Argc，對照組加入相同濃度的含GST蛋白的洗脫緩沖液.孵育24h后顯微鏡下測量劃痕處向外爬行的距離，并對劃痕寬度等距取點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)在圖中用誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差，單因素分析采用Student’s t檢驗(yàn)，＊P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.＊＊＊P＜0.001表示差異極顯著.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－1－Argc的構(gòu)建

將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－1－Argc進(jìn)行BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切鑒定，獲得了81bp的片段的酶切片段，與預(yù)期大小一致（圖1）.陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物公司測序，測序結(jié)果與目的基因片段序列完全一致，表明重組表達(dá)質(zhì)粒已成功構(gòu)建.

2.2 GST－Argc的表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－Argc轉(zhuǎn)入E.coli DH5α中，誘導(dǎo)表達(dá)獲得 GST－Argc融合蛋白，用 Tris－glycine－SDS－PAGE檢測蛋白純度.如圖2，SDS－PAGE膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色脫色后顯示，純化后的蛋白呈單一蛋白條帶，其分子量較GST蛋白略大.根據(jù)蛋白Marker指示，純化蛋白分子量比25.0kDa略大，與預(yù)期理論計(jì)算分子量28.97kDa符合.

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombination plasmid Lane 1：pGEX－4T－1－Argc double digested by BamHⅠ＋XhoⅠLane Mr：λ－EcoT 14Ⅰdigest DNA Maker

圖2 GST－Argc融合蛋白的純化Fig.2 GST－Argc purified by Glutathione Sepharose 4Fast Flow Lane Mr：Protein Molecular Weight Marker Lane1.The purified GST－Argc fusion proteinLane 2.GST protein alone

2.3 GST－Argc胰蛋白酶抑制劑活性測定

采用紫外吸收法測定活性，純化的蛋白樣品GST－Argc可與胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)，其胰蛋白酶抑制活力隨著濃度增大有所提高，呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，但此重組蛋白表現(xiàn)出的胰蛋白酶抑制劑活力極其微弱（圖3），3.3分子的GST－Argc對1分子胰蛋白酶活力的抑制率低于5%.

圖3 融合蛋白GST－Argc胰蛋白酶抑制劑活力測定Fig.3 Inhibitory curves of fusion protein against bovine trypsin

2.4 二硫鍵定量結(jié)果

采用DTNB法檢測GST－Argc自由巰基含量，計(jì)算其二硫鍵個(gè)數(shù).結(jié)果顯示，與天然產(chǎn)物相比，GSTArgc的二硫鍵個(gè)數(shù)由3對變?yōu)?對.

計(jì)算方法［6］：

式中：A412：412nm 處的吸光值；D：稀釋倍數(shù)；C：蛋白濃度（mg／mL）.

由以上公式得μmol／L SH／g（GST－Argc）＝105.62（對照GST蛋白無吸光度值），游離SH 數(shù)＝105.62·M／106＝3.06（M：GST－Argc相對分子量），二硫鍵對數(shù)＝［7＋4（總巰基數(shù)）－3.06（游離巰基數(shù)）］／2＝4，GST蛋白含有2對二硫鍵，因此Argc二硫鍵對數(shù)為4－2＝2.

2.5 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

上述結(jié)果表明該精氨酸衍生片段基本喪失胰蛋白酶抑制劑活性，且其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.因此，對其進(jìn)行其他生物學(xué)活性檢測.圖4為MTT法檢測GST－Argc對MDCK、SW480、SW620及HepG2細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果表明：GST－Argc能夠明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系.隨著藥物濃度（0、2.0、5.0、10.0 μmol／L）的增加，促增殖率依次增加（MDCK細(xì)胞10.0μmol／L劑量除外）.四種細(xì)胞中，GST－Argc（0～5.0 μmol／L間）對于MDCK促進(jìn)效率最大，但當(dāng)濃度達(dá)到10.0μmol／L時(shí)MDCK細(xì)胞增殖有所下降.在GSTArgc 5.0μmol／L濃度時(shí)，MDCK細(xì)胞促增殖率為1.2倍，SW620細(xì)胞促增殖率為0.7，SW480約為0.5，而對肝癌細(xì)胞HepG2的促增殖率最低，僅在對照基礎(chǔ)上促進(jìn)了0.2.

圖4 GST－Argc對細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of GST－Argc on cell proliferation

2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

GST－Argc對幾種細(xì)胞具有不同程度的促增殖作用，那么它對細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合、遷移是否也有影響？為此，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測它對HL7702細(xì)胞創(chuàng)傷愈合及遷移的影響.如圖5A（P106），與對照相比，GSTArgc在24h就能夠明顯的促進(jìn)HL7702細(xì)胞的遷移.在0h，對照及實(shí)驗(yàn)組劃痕寬度均約為17.3μm，而在遷移24h后，未處理細(xì)胞劃痕的寬度變?yōu)?0μm，而用GST－Argc處理后的細(xì)胞劃痕由17.3μm縮小到約5 μm.圖5B表示的分別為對照GST蛋白及GST－Argc蛋白在0h和24h時(shí)劃痕寬度的差距，處理前兩組間劃痕寬度無顯著性差異，處理24h后，實(shí)驗(yàn)組明顯比對照組遷移更快，劃痕寬度差達(dá)到4.3μm，表明GSTArgc具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用.

3 討論

MBTI具有賴氨酸和精氨酸兩個(gè)活性中心.研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，來自MBTI的賴氨酸活性中心具有較強(qiáng)的胰蛋白酶抑制劑活性，1.3分子的賴氨酸活性片段即可完全抑制1分子的胰蛋白酶的活力［7］.本研究構(gòu)建的Argc片段，由于結(jié)構(gòu)變化致使其胰蛋白酶抑制劑活性基本喪失，3.3分子該片段對1分子胰蛋白酶活力的抑制率不足5%.

Argc衍生片段幾乎不具胰蛋白酶抑制劑活性，已知該蛋白含有豐富的巰基，巰基是非?；顫姷幕鶊F(tuán)，具有抗氧化作用，它可以與活性氧自由基結(jié)合，降低其毒性作用，并對氧自由基引起的細(xì)胞損傷起防御作用.巰基水平下降是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素.通過對該蛋白進(jìn)行二硫鍵定量，發(fā)現(xiàn)Argc只含有2對二硫鍵，與天然產(chǎn)物中Arg片段所含有二硫鍵數(shù)目相比，由原來的3對二硫鍵減少為2對.已知該活性片段總的巰基數(shù)不變，但形成的二硫鍵個(gè)數(shù)減少，也就意味著自由巰基數(shù)的增加，游離的自由巰基可能對細(xì)胞的某些生理效應(yīng)具有影響.

圖5 GST－Argc對細(xì)胞HL7702傷口愈合的影響Fig.5 Effects of GST－Argc on cell HL7702wound healing

已知有些蛋白酶抑制劑能夠有效的抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［8－10］.本研究發(fā)現(xiàn)MBTI－Argc無論對正常細(xì)胞MDCK，還是癌細(xì)胞SW480、SW620、HepG2均表現(xiàn)出促細(xì)胞生長的效應(yīng)，但它對正常細(xì)胞的促進(jìn)作用明顯大于癌細(xì)胞.研究還表明，該衍生物對SW480、SW620、HepG2細(xì)胞增殖作用具劑量依賴性.研究結(jié)果顯示，10μmol／L Argc對MDCK細(xì)胞的促增殖效應(yīng)較5μmol／L的劑量有所降低，究其原因可能是MDCK細(xì)胞是正常細(xì)胞，對Argc的反應(yīng)較SW480、SW620、HepG2這些癌細(xì)胞更敏感，而高濃度的Argc（10 μmol／L）可能導(dǎo)致了MDCK細(xì)胞表面的受體發(fā)生脫敏效應(yīng).采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測該蛋白對HL7702細(xì)胞創(chuàng)傷愈合及遷移的影響，發(fā)現(xiàn)該衍生物具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用.推測其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮可能是由于其構(gòu)象的改變及二硫鍵的重組再構(gòu).Argc衍生物的這一特點(diǎn)與α2－巨球蛋白（α2－macroglobulin，α2－M）非常類似.全長的α2－M是血液中的一種蛋白酶抑制劑［11］，當(dāng)α2－M截短活化后成為α2－M＊，喪失了蛋白酶抑制活性，卻能夠結(jié)合細(xì)胞表面的受體（如LRP和GRP78）［12］，表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡的特性.因此，我們推測Argc可能也以類似的方式與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞的增殖信號(hào)通路，發(fā)揮類生長因子的作用.其細(xì)胞表面的受體以及發(fā)揮作用的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究.

綜上所述，Argc可能具有促進(jìn)組織細(xì)胞損傷修復(fù)的藥用潛力.本研究中的GST－Argc分子量約為28 kD，分子量較小，在體內(nèi)可以避免產(chǎn)生過多的免疫副反應(yīng)，具有較好的藥物應(yīng)用潛力.接下來，我們將進(jìn)一步通過免疫沉淀等技術(shù)探討該重組活性片段在細(xì)胞表面的可能受體，并對其發(fā)揮效應(yīng)的分子信號(hào)通路進(jìn)行探討，為其藥物學(xué)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

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