金竹萍，方慧慧，張麗萍，羅雅楠，喬增杰，龔澤華，裴雁曦＊

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051）

硫化氫（H2S）在常溫下是一種無色有臭雞蛋氣味的氣體，長期以來一直被科學(xué)家們當(dāng)成有毒氣體看待，認(rèn)為它對(duì)人體有害無益.直到2008年楊廣東等在Science發(fā)表論文，表明H2S參與了生理性血管擴(kuò)張和血壓的調(diào)節(jié)，將H2S的研究推向一個(gè)高峰［1］.之后越來越多的證據(jù)表明H2S在動(dòng)物體中是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的又一種氣體信號(hào)分子［2－3］.

植物體的內(nèi)源H2S主要以L／D－半胱氨酸為底物，通過半胱氨酸脫巰基酶催化產(chǎn)生H2S、丙酮酸鹽和NH3；也可以通過葉片吸收大氣中的H2S；或者在亞硫酸鹽還原酶的作用下，將SO2－3直接還原成H2S［4］.植物中已經(jīng)克隆到與內(nèi)源H2S產(chǎn)生直接相關(guān)的基因：L型半胱氨酸脫巰基酶編碼基因（L－cysteine desulphydrase，LCD）At3g62130［5］和D型半胱氨酸脫巰基酶編碼基因（D－cysteine desulphydrase，DCD）At1g48420［6］.H2S在植物體內(nèi)生理作用的研究剛剛起步，相繼有報(bào)道證實(shí)H2S可增強(qiáng)植物的抗氧化脅迫能力，增加植物非生物脅迫抗性［7－10］、促進(jìn)根的形成和種子的萌發(fā)等［11－12］.目前絕大多數(shù)研究停留在外源施加H2S供體后，對(duì)供試材料進(jìn)行表型觀察和生理生化指標(biāo)測定，而對(duì)內(nèi)源H2S在植物體內(nèi)重要生理作用的機(jī)制卻知之甚少.

本文通過聚乙二醇（PEG）模擬干旱脅迫，以擬南芥野生型和H2S產(chǎn)生酶的編碼基因LCD的缺失突變體為實(shí)驗(yàn)材料，通過對(duì)脅迫前后種子萌發(fā)率和抗氧化酶等活性的測定，揭示了內(nèi)源H2S對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana）在干旱脅迫條件下的生理影響.

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥生態(tài)型Columbia；購買美國俄亥俄州立大學(xué)（ABRC）的T－DNA插入突變體lcd（SALK＿082099）種子，經(jīng)分子鑒定，雜合植株自交獲得純合株系.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

PEG處理參考張依章等的方法［13］，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，質(zhì)量濃度（g／mL）梯度設(shè)定為0、0.1、0.15、0.17、0.19、0.25、0.3.播種消毒后的野生型（wild type，WT）種子，200粒／皿，每個(gè)PEG濃度梯度重復(fù)3次.置于人工氣候箱內(nèi)，（23±1）℃，光照強(qiáng)度2000lx，16h光照／8h黑暗周期培養(yǎng).1周后記錄種子的萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率.萌發(fā)率

將種子萌發(fā)率為50%的PEG濃度作為種子萌發(fā)的半抑制濃度.在半抑制濃度的培養(yǎng)基上同時(shí)播種WT和lcd種子，培養(yǎng)1周后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率進(jìn)行比較.

將1／2MS培養(yǎng)基上生長2周的WT和lcd幼苗取出并分為兩部分：一部分進(jìn)行H2S產(chǎn)率測定和材料脫水處理［7］，

另一部分幼苗的根部浸泡于0.3g／mL PEG溶液中5h，分別將脅迫前后的材料用50mmol／L Tris－HCl緩沖液（pH 7.8）提取粗蛋白.超氧化物歧化酶SOD活性采用A001－1試劑盒（南京建成生物公司）測定；過氧化氫酶CAT、過氧化物酶POD、抗壞血酸過氧化物酶APX的活性及丙二醛MDA含量測定參考李忠光等的方法［14］；過氧化氫 H2O2的測定方法采用DAB顯色法［15］.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用SPSS Statistics 17.0分析軟件進(jìn)行單因素比較，P＜0.05和P＜0.01分別為差異顯著和差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG干旱脅迫下WT和lcd的種子萌發(fā)

選取狀態(tài)一致的WT種子，在上述不同PEG濃度條件下培養(yǎng)1周，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率.結(jié)果顯示：對(duì)照組的萌發(fā)率為100%，隨著PEG濃度的升高，萌發(fā)率逐漸降低.PEG濃度為0.17g／mL時(shí)，萌發(fā)率降低為50%，是擬南芥WT種子萌發(fā)的半抑制濃度；當(dāng)PEG濃度增加到0.25g／mL時(shí)，WT種子的萌發(fā)受到完全抑制.以0.17g／mL PEG為培養(yǎng)濃度，同時(shí)播種Col和lcd種子，1周后再觀察其萌發(fā)情況，結(jié)果如圖1（a）所示.WT的萌發(fā)率大約為50%，lcd種子萌發(fā)率與之相比下降約40%，兩者的差異極顯著（P＜0.01）.

圖1 WT和lcd的H2S產(chǎn)率（b）、失水率（c）及其在干旱脅迫下的種子萌發(fā)率（a）Fig.1 H2S production rate（b），water loss rate（c）and germination rate（a）of WT and lcd under drought stress

2.2 WT和lcd的H2S產(chǎn)率和失水率

為探究萌發(fā)率差異的原因，對(duì)兩種材料的H2S產(chǎn)率和失水率進(jìn)行了測定.突變體lcd的H2S產(chǎn)率僅為WT的61.86%，兩者存在顯著差異（P＜0.05）（圖1b）；隨著脫水時(shí)間的延長，lcd的失水速度明顯較 WT快（圖1c），且表現(xiàn)為更嚴(yán)重的萎蔫狀態(tài).為了進(jìn)一步揭示內(nèi)源H2S對(duì)植物體在干旱脅迫下的作用機(jī)制，測定以下相關(guān)的生理指標(biāo).

2.3 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥體內(nèi)H2O2的影響

H2O2是對(duì)植物體具有極強(qiáng)毒害作用的活性氧，幾乎能氧化所有的細(xì)胞組分.采用DAB顯色法來顯示葉片中H2O2的含量，結(jié)果如P116圖2（a）所示.脅迫前的野生型WT葉片中幾乎沒有H2O2，而突變體lcd葉片內(nèi)H2O2較多.PEG干旱脅迫后，WT和lcd葉片中的H2O2斑點(diǎn)數(shù)量明顯增加，尤其是lcd中的斑點(diǎn)更密集、顏色更深.

2.4 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥體內(nèi)MDA的影響

MDA含量可以反映植物膜脂過氧化的水平和對(duì)細(xì)胞膜的傷害程度.圖2（b）所示是野生型WT和突變體lcd在PEG處理后體內(nèi)MDA含量的變化情況.可以看出，在PEG脅迫前，WT體內(nèi)MDA含量為lcd的80%，但沒有顯著差異（P＞0.05）.經(jīng)過PEG脅迫處理后，WT和lcd體內(nèi)MDA含量均增加，且兩者相差1.56倍，差異極顯著（P＜0.01）.

2.5 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥POD活性的影響

POD是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的酶，通過POD活性可以了解某一時(shí)期植物體內(nèi)生理代謝的變化.由圖2（c）得知，脅迫前野生型 WT的POD活性與突變體lcd相比，沒有顯著差異（P＞0.05）.隨著PEG的脅迫，其活性在二者體內(nèi)均有明顯的升高，WT在脅迫處理后POD活性提高了28.64%；而lcd則比處理前相比提高了2.11倍，與脅迫后的WT相比具極顯著差異（P＜0.01）.

2.6 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥CAT活性的影響

CAT在活性氧（ROS）代謝過程中，將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，使生物機(jī)體免受H2O2的毒害作用.由圖2（d）可知，在正常培養(yǎng)條件下，野生型WT體內(nèi)CAT的活性較低，突變體lcd與其相比具有顯著差異（P＜0.05）.經(jīng)過PEG脅迫后，lcd的CAT活性為脅迫前的1.84倍，差異極顯著（P＜0.01），且與 WT相比也有極顯著增加（P＜0.01）.

2.7 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥SOD活性的影響

SOD可以催化氧自由基的歧化反應(yīng)，生成H2O2，然后再進(jìn)一步被CAT轉(zhuǎn)化.因此SOD可看作是植物抗氧化的第一道防線.從圖2（e）可以看出，PEG脅迫前野生型WT的SOD活性與突變體lcd相比，沒有顯著差異（P＞0.05）.PEG脅迫處理后，WT和lcd的SOD活性分別提高了1.26倍和2.22倍，且兩者之間具有極顯著差異（P＜0.01）.

2.8 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥APX活性的影響

APX在ROS代謝過程中，以還原型抗壞血酸為底物對(duì)H2O2進(jìn)行清除，使脂質(zhì)過氧化作用減弱.從圖2（f）可以看出，脅迫前的突變體lcd與野生型 WT相比，APX活性無顯著差異（P＞0.05）.經(jīng)過PEG進(jìn)行脅迫之后，WT和lcd的APX活性均有極顯著增加（P＜0.01），分別為脅迫前的1.23倍和1.37倍，且脅迫后的WT和lcd的APX活性相比差異顯著（P＜0.05）.

3 討論

H2S作為重要的氣體信號(hào)分子，在植物生命活動(dòng)中的作用已受到越來越多的關(guān)注.隨著研究的不斷深入，外源H2S對(duì)植物體的生理作用表現(xiàn)得更加全面.張華等研究了H2S供體NaHS對(duì)Cd和Cu脅迫下小麥種子萌發(fā)的影響，說明外源H2S能顯著促進(jìn)小麥種子中淀粉酶與酯酶的活性上升［12，16］.本研究以擬南芥野生型和H2S體內(nèi)生成的關(guān)鍵酶編碼基因LCD敲除突變體為實(shí)驗(yàn)材料，測定了PEG干旱脅迫后的種子萌發(fā)率.結(jié)果表明突變體lcd中由于LCD基因表達(dá)量下降，植株體內(nèi)H2S的產(chǎn)率降低，使得其種子萌發(fā)率較WT降低40%，具有極顯著差異（P＜0.01），進(jìn)一步揭示了內(nèi)源H2S可促進(jìn)植物種子萌發(fā)的作用機(jī)制.

圖2 WT和lcd在PEG脅迫下H2O2、MDA含量及各種抗氧化酶活性的比較Fig.2 Comparison of H2O2，MDA content and antioxidant enzymes activity under drought stress

此外，陸續(xù)有報(bào)道表明，外源H2S可作為一種抗氧化信號(hào)分子，提高植物的抗旱性［7－9］、緩解鉻和銅等重金屬毒性［10，12］.植物處在干旱和重金屬等非生物脅迫的環(huán)境中時(shí)，會(huì)直接或間接地產(chǎn)生活性氧（ROS）［17］，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用.植物體在長期適應(yīng)環(huán)境的過程中，進(jìn)化出一套完整的酶促保衛(wèi)系統(tǒng)，包括SOD、POD、CAT和APX等，能夠清除大量自由基，從而降低或消除ROS對(duì)脂膜的傷害.有研究結(jié)果表明，在干旱、重金屬等非生物脅迫條件下，外源施加H2S供體可使抗氧化酶的活性升高，MDA和H2O2的含量下降［9－10，12］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：WT和lcd在PEG脅迫處理前，H2O2的斑點(diǎn)密度和顏色及略高的MDA含量，表明突變體lcd已有H2O2的積累，但大部分抗氧化酶的活性都未呈現(xiàn)顯著差異；而經(jīng)PEG脅迫處理后，H2O2的積累量和MDA含量極顯著增加，SOD、POD和CAT活性較處理前均有不同幅度的增加，而且lcd與WT相比也有極顯著差異（P＜0.01）.也就是說，正常生長條件下，WT和lcd中的H2O2含量無顯著差異，因此兩者的抗氧化酶活性差異不顯著（P＞0.05）.經(jīng)PEG脅迫處理后，由于H2S信號(hào)的缺失，使得lcd中H2O2的含量增加，氧化損傷的程度更為嚴(yán)重，植物通過提高抗氧化酶活性，達(dá)到清除ROS的目的.因此在干旱脅迫條件下，H2S對(duì)ROS的清除有促進(jìn)作用，可能與植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)是平行關(guān)系，兩者共同作用最終清除ROS.這與外源NO可以使重金屬As脅迫下的水稻抗氧化酶活性下降的結(jié)果相一致［18］.

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