金桂蘭，何慧珍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210046)

干燥綜合征(Siccasyndrome，SS)又名斯耶格倫綜合征(Sjoren’S syndrome，SS)，是一種主要累及外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫性疾病。以淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的病變主要侵犯淚腺和大小唾液腺等外分泌腺，導(dǎo)致腺體破壞和分泌減少，同時可累及全身多個系統(tǒng)組織，引起內(nèi)臟損害。近年來有學(xué)者證實，水分子通道蛋白-5(aquaporins-5，AQP5)與涎腺的分布以及腺泡細(xì)胞的轉(zhuǎn)運異常密切相關(guān)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，AQP5亦存在于角膜上皮和淚腺中［2］，可見唾液、淚液的分泌均與其有關(guān)。本文從AQP5角度探究“養(yǎng)陰益氣、布津通絡(luò)法”治療SS的機(jī)理，為SS的治療提供靶點，有助于從細(xì)胞分子水平明確SS的發(fā)病機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

清潔級雌性 SD大鼠，體質(zhì)量 220g～250g;BALb/C雌性小鼠60只，10周齡，體質(zhì)量20g～22g左右(蘇州愛爾麥特科技有限公司提供，動物合格證號SCXK(蘇)2009-0001號)。

1.2 藥物

增液布津湯(由黃芪 20g、麥冬 20g、太子參10g、枸杞子 10g、生地 15g、赤白芍各 10g、桃仁 10g和紫菀10g組成，購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診部)加入8～10倍水浸泡1 h，煎煮2次，每次煎煮40min合并濾液，水浴蒸發(fā)濃縮(每毫升含生藥1.365g)置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。環(huán)戊硫酮片(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司提供，每片25mg)25mg溶于50ml蒸餾水中，配制成0.5mg/ml的藥液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

弗氏完全佐劑(Sigma公司，LOT:129K8700);考馬斯亮藍(lán)(G250，RαD公司進(jìn)口分裝，批號911010);吸附無細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗，武漢生物制品研究所，批號091147-4);卡介苗(BCG，上海生物制品研究所，批號09061301);小牛血清(BSA，杭州四季青生物公司，批號080517);AQP5抗體(購自美國Santa Cruz公司);二抗(羊抗兔二抗，購自上海博奧森公司);PMSF(苯甲基磺酰氟，購自南京生興生物技術(shù)公司);丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、SDS(十二烷基磺酸鈉)、β-巰基乙醇、Glycine(甘氨酸)、Tris-base、溴酚藍(lán)、TEMED(四甲基二乙胺)、AP(過硫酸胺)(均購自 Sigma公司，北京夏斯生物技術(shù)公司分裝);Western blotting electrochemiluminescence(ECL，購自 Amersham 公司);硝酸纖維膜(NC，購自 Amersham公司);脫脂奶粉(光明公司);蛋白定量試劑盒(購自 BIO-RAD公司)。

1.4 實驗儀器

SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);5810R型低溫超速離心機(jī)(德國EPPENDORE公司);XHF-1高速勻漿器(上海金達(dá)生化儀器廠);JA1203型電子天平(上海天平儀器廠);MAX 190型酶標(biāo)儀(美國AD公司);ELISA試劑盒(RαD公司分裝);醫(yī)用X光片(購自Kodak公司);Power Pac Basic電泳儀(購自BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 SS小鼠模型制作及分組給藥

取BALB/C小鼠60只隨機(jī)分為6組:正常對照組(生理鹽水 20 ml·kg－1)，模型組(生理鹽水 20 ml·kg－1)，增液布津湯低劑量組(6.8g·kg－1)，增液布津湯中劑量組(13.6g·kg－1)，增液布津湯高劑量組(27.3g·kg－1)，環(huán)戊硫酮組(1.25g·kg－1)。取5只SD大鼠頜下腺，分離包膜及結(jié)締組織，剔除淋巴結(jié)，每0.1 g置入10ml無菌試管中，加氯化鈉注射液2ml，在冰浴中用勻漿器勻漿，再在4℃低溫離心機(jī)中離心。離心后利用考馬斯亮藍(lán)比色法測定其蛋白含量。根據(jù)預(yù)實驗及參考文獻(xiàn)［3］，將該上清液加入滅菌生理鹽水中稀釋成0.4g·L1的上清液，再與弗氏完全佐劑混合，制備終濃度為0.2g·L－1乳化抗原液。于小鼠兩后腳掌及兩側(cè)腹股溝sc乳化抗原，每只 0.2 ml(含卡介苗 3.75g·L－1)，同時 sc白喉-百日咳-破傷風(fēng)三聯(lián)疫苗，每只0.1ml。首次免疫后第3、7天，用乳化抗原對模型組和用藥組加強(qiáng)免疫，劑量0.2ml，多點背部 sc。以后每隔14d用乳化抗原加強(qiáng)免疫1次，劑量同首次，共加強(qiáng)免疫2次，多點背部 sc，正常對照組不作任何處理。于免疫后當(dāng)天開始灌胃增液布津湯，劑量分別為:增液布津湯低劑量組(ZYBJⅠ6.8g·kg－1)，中劑量組(ZYBJⅡ13.6g·kg－1)，高劑量組(ZYBJⅢ27.3g·kg－1)，環(huán)戊硫酮組(12.5mg·kg－1)，正常對照組(生理鹽水 20ml·kg－1，模型組對照組(生理鹽水20ml·kg－1)。以上各組每日灌胃1次，連續(xù)5d，停藥2d，第50天眼球放血處死，立即取一側(cè)頜下腺，置于-70℃冰箱中用于Western blot分析AQP5表達(dá)量的變化。

2.2 唾液流量的測定

于免疫后第 10、20、30、40、50 天分別測定給藥后小鼠唾液分泌量。測量前禁食1 h，不禁水。將無菌脫脂棉球制成干重5mg的棉球。測唾液分泌時將已經(jīng)稱好干重的棉球放入小鼠后頰部，3min后取出，電子天平上稱濕重。唾液分泌量(mg)=棉球濕重－棉球干重。

2.3 鏡下觀察頜下腺病理變化

實驗結(jié)束第50天時眼眶取血，處死小鼠立即取一側(cè)頜下腺經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色。

2.4 Western印跡分析

2.4.1 組織總蛋白提取 (1)取出-70℃冰箱中的標(biāo)本，稱取各組標(biāo)本500mg，將組織置于2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎;(2)加400ul單去污劑裂解液(含 PMSF)于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。裂解30min后，即用移液器將裂解液移至1.5ml離心管，然后在 4℃下 12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于 －20℃保存。

2.4.2 Bradford方法定量蛋白濃度 (1)將標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋為以下6個濃度(mg/ml):0.02、0.05、0.10、0.20、0.40 和 0.80，各 取 2、5、10、20、40、80μL，再加入buffer和雙蒸水(ddH2O)，使總體積為150μL;Sample為 20 倍稀釋，取 20μL，加入 130μL雙蒸水(ddH2O)，常溫作用20min;(2)各孔加入150μL經(jīng) 3倍稀釋的蛋白定量試劑(Coomassie Protein Reagent)，共 300μL反應(yīng)溶液，室溫下作用10min。酶標(biāo)儀550nm處測得吸光度。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作曲線(利用Excel繪制回歸曲線)，得線性回歸方程:Y=0.8004X+0.5398，R2=0.9737，將測定 OD 值代入方程式，計算蛋白質(zhì)濃度;(3)測樣本濃度:將待測標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的濃度，乘以適當(dāng)稀釋倍數(shù)即為樣本濃度。

2.4.3 免疫印跡測定方法及步驟 (1)樣品按比例加入6×上樣緩沖液，100℃加熱5min使蛋白變性;(2)根據(jù)蛋白定量結(jié)果上樣，使最終上樣總蛋白為60μg。取適量處理后的樣品完全加入上樣孔。Tris-Glycine電泳緩沖液以100V恒壓電泳，至溴酚蘭到電泳槽最下端;(3)卸下電泳裝置，撬開玻璃板取下凝膠;(4)將凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，以95mA電壓轉(zhuǎn)膜75min，將分離的蛋白條轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上;(5)蛋白質(zhì)標(biāo)記:一抗孵育:用 PBS-T(PBS，0.05%Tween-20)洗膜 2次，5min/次。使用阻斷劑(無菌PBS中含5%脫脂牛奶)37℃孵育1h，阻斷硝酸纖維素膜上的非特異性蛋白結(jié)合位點。置于1∶1000(或按抗體生產(chǎn)廠家建議的稀釋度)稀釋的特異性抗體反應(yīng)液(無菌 PBS，抗體，1%脫脂牛奶)，放在脫色搖床上，4℃過夜;(6)二抗孵育:棄一抗，用PBS-T洗膜2次，5min/次，去除多余的一抗反應(yīng)液和非特異性吸附的抗體。加入含1∶5000稀釋的過氧化物酶聯(lián)二抗反應(yīng)液(無菌PBS，抗體，1%脫脂牛奶)，37℃搖動，孵育2h;(7)曝片:PBS-T洗膜3次，5min/次。加ECL-plus發(fā)光顯色液，室溫作用1min后暗盒曝片。顯影之后根據(jù)Western Blot彩色標(biāo)準(zhǔn)電泳指示條帶(Marker)的位置，分析所測電泳條帶的性質(zhì)。以GAPDH作為內(nèi)參。電泳條帶經(jīng)Image J軟件處理，分析各實驗組條帶與對照組條帶面積、灰度比值，進(jìn)一步用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用多組重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析，若方差不齊用秩和檢驗。設(shè)P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義的界值，以P＜0.05和 P＜0.01分別表示差異顯著和非常顯著。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠唾液量變化比較

表1顯示，實驗過程中動態(tài)測定各組小鼠唾液流量的變化:(1)實驗第10～20天各組模型小鼠唾液流量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);(2)從第30天開始與正常對照組比較，模型組小鼠唾液流量明顯減少(P＜0.01);與模型組比較，中藥中、高劑量組小鼠唾液流量明顯增加(P＜0.05);(3)第50天與正常對照組比較，模型組、中藥低劑量組小鼠唾液流量明顯減少(P＜0.01，P＜0.05);與模型組比較，中藥各劑量組、環(huán)戊硫酮組小鼠唾液流量明顯增加(P＜0.01)。

表1 增液布津湯對SS模型小鼠唾液流量的影響(珋x±s，n=10)

3.2 光鏡觀察頜下腺病理變化

圖1顯示，正常對照組頜下腺呈分葉狀，腺泡大小規(guī)則，排列緊密，腺泡上皮和導(dǎo)管未見變性、壞死，間質(zhì)未見充血及淋巴細(xì)胞浸潤等病理變化。模型組大部分可見腺體中度萎縮，腺泡大小不等，數(shù)量減少，上皮變性、壞死，導(dǎo)管擴(kuò)張，腺泡周圍中重度淋巴細(xì)胞浸潤。而增液布津湯中，高劑量及環(huán)戊硫酮組腺體萎縮程度減輕，腺泡排列緊密，腺泡上皮輕度變性、壞死，導(dǎo)管輕度擴(kuò)張，腺泡周圍組織有輕度淋巴細(xì)胞浸潤，尤其是高劑量組僅見個別淋巴細(xì)胞浸潤，腺泡、導(dǎo)管、腺泡上皮等接近于正常表現(xiàn)。

3.3 免疫印跡(western blot)分析

圖2表 2顯示，以 GAPDH作為內(nèi)參照，用Image J軟件處理，分析各實驗組條帶與對照組條帶面積、灰度比值，分別出現(xiàn)分子量為35KD、37KD的條帶。各組AQP5表達(dá)量比較結(jié)果示，與正常對照組比較，模型組 AQP5表達(dá)量下降27.90%(Ρ＜0.01);與模型組比較，增液布津湯高、中、低劑量組AQP5表達(dá)量分別升高 32.84%(Ρ＜0.01)、12.54%(Ρ＜0.05)、4.51%，同時環(huán)戊硫酮組 AQP5表達(dá)量升高20.40%(Ρ＜0.01)，說明增液布津湯可以增加頜下腺AQP5的表達(dá)量，促進(jìn)唾液分泌，改善SS模型小鼠口干癥狀。

4 討論

圖1 增液布津湯對SS模型小鼠頜下腺組織結(jié)構(gòu)變化的影響(HE×200)

圖2 各組AQP-5表達(dá)的western blot檢測結(jié)果

現(xiàn)代研究認(rèn)為，干燥綜合征的病理機(jī)制主要是由于自身免疫的異常反應(yīng)，通過各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)造成外分泌腺體大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，使腺體細(xì)胞破壞、功能喪失［4］。SS患者在靜息和刺激狀態(tài)下唾液流率均降低，可以導(dǎo)致言語困難、進(jìn)食障礙、口腔念珠菌病、猖齲齒和慢性涎腺炎等一系列病變。在哺乳動物內(nèi)，迄今至少已發(fā)現(xiàn)10種水通道蛋白亞型(從 AQP0到 AQP9)，其中已證實AQP1和AQP5與人唾液分泌密切相關(guān)，分別在不同唾液腺組織結(jié)構(gòu)中起重要作用［5，6］。SS病變在各器官的共同病理是淋巴細(xì)胞的浸潤，無論是淺表外分泌腺還是內(nèi)臟外分泌腺，其損傷部位均是針對上皮，如唾液腺上皮、腎小管上皮、支氣管上皮等，而上皮細(xì)胞是水通道蛋白分布的主要部位，表明水通道蛋白與SS的發(fā)病確實存在某種聯(lián)系。

表2 各組AQP5表達(dá)的相對灰度值比較(珋x±s，n=3)

該病在中醫(yī)古典醫(yī)籍中并無此病名，根據(jù)其臨床“燥象叢生”的特點，多數(shù)醫(yī)家將其歸于“燥痹”范疇，其病機(jī)特點為本虛標(biāo)實。本虛即為諸臟腑氣血陰陽虧虛，其中主要為陰液虧損、津枯液涸、臟腑不榮、津液輸布失常，而標(biāo)實主要是瘀毒互結(jié)。所以我們認(rèn)為，陰虛、燥毒、瘀血是 SS發(fā)病的主要原因，三者之間相互為患，導(dǎo)致津液運行受阻，輸布不暢，口眼失其滋潤，內(nèi)及五臟六腑亦失其所養(yǎng)，以此為據(jù)，擬用益氣養(yǎng)陰、清燥解毒、活血化瘀、布津通絡(luò)的增液布津湯治療本病。藥物由麥冬、黃芪、太子參、枸杞子、生地、赤白芍、桃仁、紫菀8味藥物組成。研究表明，水通道蛋白在肺、腎、消化系統(tǒng)等器官廣泛存在［7］，而中醫(yī)理論認(rèn)為體內(nèi)津液代謝主要與肺、脾、腎三臟相關(guān)，表明津液的代謝過程與水通道蛋白之間確實有著某種聯(lián)系。本實驗唾液流量結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠唾液流量明顯下降，用增液布津湯治療后可以促進(jìn)SS小鼠唾液分泌，改善口干癥狀，作用與環(huán)戊硫酮效果相當(dāng)。免疫印跡結(jié)果顯示，模型組的AQP-5表達(dá)水平與正常對照組比較下降了27.90;給藥處理的高、中、低劑量組 AQP-5表達(dá)水平與模型組比較分別升高了32.84%、12.54%、4.51%，說明增液布津湯高劑量能夠顯著促進(jìn)AQP-5的表達(dá)。

綜上所述，當(dāng) SS頜下腺重度破壞時，AQP5的表達(dá)量顯著減少，導(dǎo)致水分轉(zhuǎn)運失代償，引起唾液分泌減少，出現(xiàn)口干癥狀。本實驗結(jié)果初步表明，增液布津湯可能通過抑制SS模型小鼠頜下腺萎縮、淋巴細(xì)胞浸潤的病理進(jìn)程，促進(jìn)AQP5的表達(dá)，從而改善唾液腺分泌功能，增加唾液流量，緩解 SS口腔干燥癥狀。

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