章鵬宇，朱 琳，王景杰

第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院消化內科，陜西 西安 710038

超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道(HCN)廣泛表達于循環(huán)和神經系統(tǒng)，在心臟起搏、神經系統(tǒng)活動中發(fā)揮重要的作用;前期研究表明HCN1在大鼠胃電起搏區(qū)和回盲部的Cajal細胞上明確存在，并特異性存在于ICCs，可能是Cajal細胞重要離子通道的物質基礎，與Cajal細胞的起搏作用有關;HCN2陽性細胞在成年小鼠胃腸道肌間神經叢成簇緊密排列，并與神經遞質P物質、血管活性腸肽及降鈣素基因相關肽共存，在調控胃腸神經活動、調節(jié)胃腸功能方面起著重要的作用[1-2]。我們的前期研究表明HCN-1在小腸黏膜和平滑肌間隙中存在，且其在胃腸道缺血狀況下在小腸的表達明顯增高，提示HCN-1可能與胃腸道的動力起搏或調解方面起著較為重要的作用[3]。而SP、CGRP作為參與胃腸活動調節(jié)的神經遞質，在腸道中同HCN-1的作用是否相關，具有重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組:Sprague-Dawley雄性大鼠15只，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，鼠齡12周，體質量(200±20)g，動物飼養(yǎng)溫度控制在(20±2)℃，喂養(yǎng)常規(guī)鼠食和自來水，12 h黑暗光明周期。按照完全隨機分組分成正常組、假手術組、小腸缺血改變組3組，每組5只。

1.1.2 實驗方法:正常組大鼠取標本前正常飼養(yǎng)，小腸缺血改變組為手術設定在無菌條件下，10%烏拉坦腹腔麻醉(10 mL/kg)，通過大鼠腹部正中切口開腹，找到腸系膜上動脈，并用絲線不完全結扎，關腹繼續(xù)飼養(yǎng)5 d，等待處死取材;假手術組只做單純開腹，不做結扎，關腹后正常飼養(yǎng)5 d，等待處死取材。

1.1.3 實驗儀器、試劑:超低溫切片機(Leica公司)、激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司)、兔抗大鼠HCN1多抗(Abcam公司)、羊抗大鼠CGRP多抗(Abcam公司)、鼠抗兔SP單抗(Abcam公司)。

1.2 取材與檢測

1.2.1 標本固定與取材:電生理測定完成后處死大鼠，剖開左側胸腔，撥開心包膜，暴露心臟。剪開右心耳放出血液，再剪開左心室將16號灌注針沿切口插入左心室至升主動脈根部用動脈夾固定，先輸入100 mL生理鹽水將血管內的血球沖干凈，再注入多聚甲醛固定液灌流400 mL進行固定，調整滴速，緩慢滴注，流出清亮液體。待固定完全后，取腸系膜上動脈結扎后支配區(qū)域小腸，正常組及小腸缺血改變組取相同部位小腸，將所取小腸組織放置20%的蔗糖溶液中過夜沉底。

1.2.2 組織冰凍切片制作:取固定好的小腸組織用超低溫切片機(Leica公司)切片10 μm，待染。

1.2.3 雙重熒光免疫組織化學標記(間接法):將標本置于0.3%H2O2－甲醇中浸泡30 min封閉內源性過氧化物酶，0.1%Triton浸泡30 min，PBS漂洗，標本先后加入一抗，即免疫血清稀釋的1∶50兔抗大鼠HCN1多抗、1∶50羊抗大鼠CGRP多抗，4℃孵育過夜(約14 h)，第2天將切片和鋪片置于室溫下復溫1 h，經PBS漂洗后，先后加入1∶1000 FITC標記的驢抗羊IgG二抗及1∶1000 TexasRed標記的驢抗兔IgG二抗，室溫孵育3 h，PBS漂洗后，將鋪片平置于載玻片上，與切片標本同時用60%緩沖甘油封片。以上過程均需避光操作。同樣過程標記HCN-1與SP。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡采圖分析:每一張切片取4～6個視野，將數字化圖像儲存于LSCM系統(tǒng)的計算機，采用40倍視野觀察HCN-1與SP、CGRP的分布及3個實驗分組之間的變化情況。

1.3 統(tǒng)計學分析 對免疫熒光雙標記圖像進行Image J軟件進行比較，結果用表示，并用SPSS ver.13.0進行完全隨機隨組方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗結果顯示:正常狀態(tài)下，HCN1與促胃腸動力的興奮性遞質SP和抑制性神經遞質CGRP存在遞質共存。然而，因小腸缺血性改變可以導致這種共存遞質的SP和CGRP反應水平提高，而HCN1的水平與SP及CGRP的情況相反，其表達水平仍較正常組和假手術組為低:即正常組和假手術組大鼠的SP熒光光度值OD為54±5和57±5，與之雙標的HCN1熒光光度值OD為73±5;正常組和假手術組大鼠的CGRP熒光光度值OD為72±5和75±5，與之雙標的HCN1熒光光度值OD為73±5，兩組間SP的表達未見顯著性差異，但均較缺血改變模型的表達低(P＜0.05);小腸缺血組的熒光光度值變化為:SP熒光光度值OD為125±5;CGRP熒光光度值OD為167±5;HCN1熒光光度值OD為46±5。差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見圖1～4)。

3 討論

SP和CGRP是重要的胃腸肽。SP可以興奮神經，喚醒行為應答，是強有力的血管擴張劑，與許多平滑肌相關;CGRP在甲狀腺C細胞以及中樞神經、外周神經中表達，是強有力的血管擴張劑，并且可以影響心跳強度與頻率，它可以調節(jié)神經肌肉接頭處乙酰膽堿受體的功能，可以阻斷嗎啡的耐受性，可以調節(jié)皮膚朗格漢斯細胞的抗原提呈[4-11]。

我們的前期研究中，通過對缺血大鼠小腸的HCN-1與C-kit免疫熒光雙標記的檢測，可見HCN-1與C-kit陽性表達在小腸黏膜和平滑肌間隙，并且缺血改變后兩者表達明顯增高，提示HCN-1代償性引起細胞興奮性的增高，說明ICCs的HCN-1通道在調節(jié)胃腸動力方面有重要作用。

本研究發(fā)現，無論是正常組還是對照組，以及模型實驗組均存在著HCN1和興奮性遞質SP以及抑制性遞質CGRP共存的現象。這一現象提示，HCN1作為離子通道，其活動變化是受神經遞質調控的，這也符合離子通道的特性。與此同時，我們還發(fā)現，造模組的腦腸肽SP和CGRP的表達水平較正常組和假手術組高，而HCN1的表達水平卻較其為低。這一現象提示，當胃腸道功能產生障礙的情況下，興奮性促胃腸動力的調節(jié)遞質在其中可能發(fā)揮著主要的作用，而抑制性遞質也會隨著興奮性遞質的作用以及胃腸動力障礙的產生而發(fā)生水平上調。雖然胃腸道缺血性改變可使離子通道的激活狀態(tài)仍處于低活化狀態(tài)，但是，隨著側支循環(huán)的建立以及調節(jié)遞質的不斷作用，胃腸道動力的恢復會逐漸產生。綜上所述，離子通道HCN-1在大鼠小腸缺血改變后，在側支循環(huán)的不斷建立下，由于興奮性遞質的調控作用，產生障礙的胃腸動力將逐漸得到恢復。同時，抑制性遞質也在其中發(fā)揮了重要的作用，使胃腸道動力的恢復過程呈現出時效性變化。但是，無論是興奮性遞質還是抑制性遞質，都將通過離子通道HCN1發(fā)揮作用。所以，進一步提示說明HCN-1作為“始發(fā)”離子通道在胃腸道動力起搏上可能發(fā)揮重要作用，為調節(jié)胃腸功能的研究提供新的想法，并提示胃腸功能調整的新思路。

圖4 小腸缺血性改變對HCN1和CGRP表達的影響 A:正常組;B:假手術組;C:小腸缺血性改變組(Bar=100 μm)Fig4 Expressions of HCN1 and CGRP after ischemia injury of small intestine

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