宋 巖，劉秀萍，白偉良，季文樾

隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)生命學(xué)科的迅猛發(fā)展，喉癌的化療藥物研究也進(jìn)入了一個(gè)新階段［1］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，清熱類(lèi)中藥黃芪可通過(guò)調(diào)節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯及細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等發(fā)揮其抗腫瘤作用［2］。文獻(xiàn)報(bào)道其在膀胱癌、胃癌治療方面作用顯著，但在喉癌治療中的研究甚少，本文就黃芪對(duì)喉癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞株:喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。試劑:黃芪注射液購(gòu)自正大青春寶集團(tuán);Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司;MTT、碘化丙啶(Proidum iodide，PI)、二甲基亞楓(DimethyI sulfoxide，DMSO)等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司;TMPI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;RnaseA購(gòu)于碧云天;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;青鏈霉素、磷酸鹽緩沖溶液(Phophate buffered saline，PBS)購(gòu)自上海生工生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，加100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)，48 h傳一代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/L，接種于96孔板，貼壁24 h后，換成含有不同濃度黃芪(20、100、200 μg/mL)的培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔，作用24 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)試儀測(cè)定490 nm處吸光度(A)值繪制生長(zhǎng)曲線，觀察藥物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞增殖抑制率=(1-加藥孔細(xì)胞A值/對(duì)照孔細(xì)胞A值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將適當(dāng)濃度的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，加入含有不同濃度黃芪(20、100、200 μg/mL)的培養(yǎng)液，分別作用24 h，收集 1×106個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，PBS洗1次，4℃、75%冰乙醇固定24 h，PBS洗3次，上機(jī)前加入PI冰浴避光放置1 h，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106個(gè)/L，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，如此重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每瓶4×105接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，按“1.2.3”項(xiàng)方法分組處理各組細(xì)胞，繼續(xù)孵育培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用光學(xué)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，并隨機(jī)拍照。

1.2.5 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化將預(yù)處理過(guò)的蓋玻片置于6孔板內(nèi)，Hep-2細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/mL，各取1 mL種入6孔板培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞長(zhǎng)至60%～80%。給藥組加入200 μg/mL的黃芪培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，吸盡培養(yǎng)液，加入固定液0.5 mL固定15 min，PBS洗2次，加1 mL Hoechst 33258熒光染液，避光10 min，封片后熒光顯微鏡觀察，照相，見(jiàn)圖1。

圖1 Hoechst 33258熒光染色法觀察黃芪作用前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)黃芪對(duì)Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，黃芪可抑制Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)，并且隨著藥物濃度增加其生長(zhǎng)抑制率也增加，兩者存在濃度相關(guān)性。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度黃芪作用24 h后抑制率、凋亡率比較(%)

2.2 黃芪對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黃芪具有誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的作用，細(xì)胞凋亡發(fā)生率隨黃芪濃度增加而明顯增加。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度黃芪作用24 h后細(xì)胞各周期分布(%)

2.3 光鏡觀察 由倒置相差顯微鏡可以觀察到，與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，干預(yù)組都有不同程度的形態(tài)改變，見(jiàn)圖2。

2.4 Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察 200 μg/mL黃芪作用于Hep-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞發(fā)生顯著性形態(tài)學(xué)改變，出現(xiàn)大量染色質(zhì)邊聚，細(xì)胞核固縮，甚至可見(jiàn)核碎裂、核溶解特征性表現(xiàn)。凋亡的細(xì)胞隨著黃芪濃度的增加明顯增多，最后大片細(xì)胞脫落，可觀察到細(xì)胞脫失區(qū)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 光鏡下觀察黃芪作用前后Hep-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

3 討論

喉癌是常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，在中國(guó)東北發(fā)病率較高，近年來(lái)發(fā)病率在世界范圍內(nèi)也呈上升趨勢(shì)。目前，在放化療和外科手術(shù)聯(lián)合治療的情況下，Tis、T1及T2期喉癌治療有效率為80%～90%，而T3、T4期喉癌只有40%～50%。盡管外科手術(shù)和放化療技術(shù)有了明顯進(jìn)步，但患者的5年生存率仍沒(méi)有提高，原因是多方面的，其中對(duì)發(fā)病機(jī)制研究不夠完善、沒(méi)有明確的治療靶點(diǎn)是最關(guān)鍵的原因。

本研究表明，黃芪具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。MTT檢測(cè)結(jié)果表明，黃芪可抑制Hep-2細(xì)胞，且隨著藥物濃度增加其生長(zhǎng)抑制率也增加，兩者存在濃度依賴(lài)關(guān)系。濃度為20、100、200 μg/mL時(shí)，抑瘤率分別為35.38% ±0.17%、59.12% ±0.21%、84.55% ±0.27%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。抑制率隨濃度增加而逐漸上升，到 200 μg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)84.55% ±0.27%，抑瘤作用顯著，由此推斷黃芪可以在體內(nèi)外發(fā)揮對(duì)喉癌的抑制作用。筆者用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度黃芪作用Hep-2細(xì)胞后引起的細(xì)胞凋亡率的變化，發(fā)現(xiàn)20 μg/mL時(shí)凋亡率為38.2% ±1.3%，100 μg/mL時(shí)凋亡率為 87.2% ±1.7%，200 μg/mL濃度時(shí)凋亡率為94.6% ±1.3%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性，說(shuō)明黃芪可有效促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡。

筆者采用光鏡與免疫熒光染色對(duì)給藥前后喉癌Hep-2細(xì)胞進(jìn)行微觀對(duì)比，發(fā)現(xiàn)光鏡下黃芪作用細(xì)胞24 h后，隨著黃芪濃度的增加，細(xì)胞變圓，不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞間隙變大;熒光染色下，細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂，核仁消失，染色質(zhì)固縮，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，嚴(yán)重時(shí)成片細(xì)胞脫落。對(duì)照組喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)圓，胞膜表面光滑，無(wú)凋亡發(fā)生。

黃芪為多年生草本植物，主要成分為黃酮，如黃芪素。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪素可下調(diào)bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞色素C-線粒體-Caspase-3途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡［3］。Roy等［4］發(fā)現(xiàn)，小劑量黃芪素(10或20 mol/L)使人白血病HL-60細(xì)胞大量停滯于S或G2/M期，而大劑量黃芪素則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。黃芪具有誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，但其抗腫瘤機(jī)制復(fù)雜多樣，尚未完全明確［5］。筆者用不同濃度的黃芪進(jìn)行體外抑癌實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用不同方式檢測(cè)不同濃度黃芪對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的促凋亡作用，發(fā)現(xiàn)黃芪體外作用人喉癌Hep-2細(xì)胞后，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡以達(dá)到抗癌作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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［2］毛捷，徐善水，盛莉莉，等.黃芪素的抗腫瘤作用及機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，14(10):1178-1182.

［3］Lee JH，Li YC，Ip SW，et al.The role of Ca2+in baicalein induced apoptosis in human breast MDA-MB-231 cancer cells through mitochondria and caspase-3-dependent pathway［J］.Anticancer Res，2007，27(1A):117-125.

［4］Roy MK，Nakahara K，Na TV，et al.Baicalein，a flavonoid extracted from a methanolic extract of Oroxylum indicum inhibits proliferation of a cancer cell line in vitro via induction of apoptosis［J］.Pharmazie，2007，62(2):149-153.

［5］王曉瑜，龍漢安.黃芪及黃酮類(lèi)成分防治腫瘤作用的研究進(jìn)展［J］.華西醫(yī)學(xué)，2011，26(2):297-300.