王超 陳泓強(qiáng) 李亞麗 張明明

隨著社會(huì)的發(fā)展，環(huán)境污染、職業(yè)競(jìng)爭(zhēng)、生育年齡推遲等多種因素均加快了女性性腺衰老和性激素失衡，致使卵巢功能降低，導(dǎo)致了卵巢早衰、不孕、更年期提前等許多女性疾病的發(fā)生。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎方劑何首烏飲能對(duì)抗大鼠卵巢組織衰老［1］，本研究擬在前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，觀察何首烏飲對(duì)快速老化小鼠雌二醇(E2)、黃體生長(zhǎng)激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平的影響及其受體表達(dá)的變化，探討何首烏飲延緩卵巢衰老的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:SAMP8小鼠，SPF級(jí)，60只，雌性，30～40 g;SAMP1小鼠，SPF級(jí)，12只，雌性，30～40 g;購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2006-0008。

1.1.2 試劑與儀器:何首烏飲:何首烏(炙)、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓，用水提取成濃縮液。雌二醇(E2)、黃體生長(zhǎng)激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司;雌激素受體 α(ERα)、LH受體(LHR)、FSH受體(FSHR)引物均由上海生工工程公司合成;ERα小鼠單克隆抗體、LHR、FSHR兔多克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥:SAMP8小鼠，60只，隨機(jī)分為模型組、何首烏飲低劑量:10 g·kg-1、何首烏飲中劑量組:20 g·kg-1、何首烏飲高劑量組:40 g·kg-1、陽(yáng)性藥維生素VE組:35 mg/kg，每組12只動(dòng)物。另設(shè)SAMP1小鼠為對(duì)照組。何首烏飲和VE組每日分別灌胃何首烏飲和VE，連續(xù)8周，對(duì)照組和模型組灌胃給予蒸餾水。

1.2.2 血清指標(biāo)檢測(cè):采用陰道涂片法觀察小鼠動(dòng)情期，在小鼠動(dòng)情前期眼眶取血，離心，分離血清，全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢測(cè)血清E2、LH、FSH含量。

1.2.3 卵巢指數(shù)的檢測(cè):處死小鼠，取卵巢，稱重，計(jì)算卵巢指數(shù)=卵巢/體重×100%。

1.2.4 熒光定量PCR方法測(cè)定卵巢組織中ERα、LHR和FSHR mRNA的表達(dá) 取卵巢組織，Trizol一步法提取總RNA，鑒定完整性，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量PCR儀擴(kuò)增，ERα引物為:上 游 5，-TCAACTGGGCAAAGAGAGTG-3，下 游 5，-GACGAGACCAATCATCAGAATC-3，長(zhǎng)度為 104 bp;LHR引物為:上 游 5，-GGCTGGGATTACGATTATGAC-3，下 游 5，-AGGGATTGAAAGCATCTGGT-3，長(zhǎng)度為76 bp;FSHR引物為:上游5，-GTCCTGATGAGCAAGTTTGG-3，下游 5，-AGGGATTCTTTCTGGAGTGG-3，長(zhǎng) 度 為 100 bp;GAPDH 引 物 為:上 游 5，-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，下游 5，-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3，長(zhǎng)度為120 bp。完成擴(kuò)增后，以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)，以GAPDH為內(nèi)參照基因，計(jì)算ERα、LHR、FSHR表達(dá)的相對(duì)定量值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 Western-blot方法測(cè)定卵巢組織中ERα、LHR、FSHR蛋白的表達(dá)取卵巢，加入細(xì)胞裂解液研磨，離心取上清，用蛋白定量測(cè)定試劑盒進(jìn)行總蛋白測(cè)定。電泳分離蛋白，PVDF膜用脫脂奶粉常溫封閉，分別加入ERα、LHR、FSHR一抗(稀釋度1∶200～1∶500)，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋度 1∶1 000)，滴加酶的作用底物ECL，暗室中X線底片曝光，顯影，定影。將X膠片條帶掃描后輸入圖像分析系統(tǒng)，結(jié)果以與內(nèi)參照基因GAPDH的比值表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用ANOVA分析處理和Dunnet t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激素水平及卵巢指數(shù)的變化 模型組較對(duì)照組血清中E2、卵巢指數(shù)明顯下降(P＜0.01)，LH、FSH明顯上升(P ＜0.01);與模型組比較，VE組、何首烏飲組E2、卵巢指數(shù)均明顯上升(P ＜0.01)，F(xiàn)SH均明顯下降(P ＜0.01)，VE組、何首烏飲中、高劑組LH明顯下降(P＜0.01)。見表1。

表1 何首烏飲對(duì)SAMP8小鼠激素水平的影響±s

表1 何首烏飲對(duì)SAMP8小鼠激素水平的影響±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

組別 E2(pg/ml) LH(mU/ml) FSH(mU/ml) 卵巢指數(shù)(mg/100 g)52.12±10.15 2.58±0.32 1.33±0.32 43.12±5.77模型組 9.88±1.91* 21.54±4.12* 16.29±2.14* 24.98±3.68*VE組 21.34±3.69# 9.08±2.11# 10.30±2.78# 36.54±4.46#何首烏飲低劑組 17.81±2.17# 20.69±4.19 9.37±2.53# 34.11±6.67#何首烏飲中劑組 20.18±5.24# 8.91±1.25# 6.38±1.72# 40.14±5.42#何首烏飲高劑組 29.39±5.77# 4.03±0.59# 4.04±0.58# 41.13±5.85#對(duì)照組

2.2 卵巢組織中ERα、LHR、FSHR表達(dá)的變化 模型組較對(duì)照組卵巢組織中ERα、LHR、FSHR mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.01);與模型組比較，VE組、何首烏飲組ERα、LHR、FSHR mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上升(P＜0.01)。見表2。

表2 何首烏飲對(duì)SAMP8小鼠卵巢ERα、LHR、FSHR表達(dá)的影響±s

表2 何首烏飲對(duì)SAMP8小鼠卵巢ERα、LHR、FSHR表達(dá)的影響±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

蛋白對(duì)照組 0.98±0.12 0.89±0.13 0.95±0.11 0.79±0.09 1.0組別 ERα mRNA 蛋白LHR mRNA 蛋白FSHR mRNA 4±0.14 0.88±0.13模型組 0.39±0.05* 0.33±0.04* 0.37±0.05* 0.28±0.04* 0.44±0.06* 0.36±0.05*VE組 0.64±0.12# 0.55±0.06# 0.55±0.07# 0.49±0.06# 0.62±0.07# 0.53±0.06#何首烏飲低劑組 0.47±0.05# 0.41±0.05# 0.38±0.05 0.31±0.04 0.47±0.06 0.39±0.05何首烏飲中劑組 0.69±0.08# 0.65±0.07# 0.59±0.06# 0.53±0.07# 0.61±0.09# 0.68±0.09#何首烏飲高劑組 0.71±0.12# 0.69±0.08# 0.69±0.09# 0.59±0.07# 0.68±0.11# 0.75±0.11#

3 討論

卵巢衰老是女性機(jī)體衰老的開始，因此卵巢衰老越來(lái)越被人們大量關(guān)注。臨床研究認(rèn)為卵巢衰老開始的標(biāo)志是FSH水平升高［2］，通常把女性FSH≥20 mU/ml作為卵巢功能低下的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，之后的FSH、LH持續(xù)升高，E2持續(xù)降低，最后導(dǎo)致絕經(jīng)的發(fā)生［3］。我們觀察到SAMP8快速老化小鼠血清中E2水平明顯降低，LH、FSH明顯上升，同時(shí)小鼠卵巢指數(shù)明顯下降，表明SAMP8小鼠出現(xiàn)了性激素水平異常，卵巢老萎縮。何首烏飲治療組能明顯降低LH、FSH水平，升高E2，升高卵巢指數(shù)，表明何首烏飲能夠調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能，直接作用于卵巢，延緩其衰退。

雌激素在女性機(jī)體中起著重要的作用，雌激素缺乏，不僅會(huì)對(duì)女性生殖功能影響巨大，而且會(huì)引起骨質(zhì)疏松［4］、心血管?。?］等多種病癥。雌激素主要通過(guò)與其受體ER結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，激素靶器官對(duì)激素的反應(yīng)是通過(guò)循環(huán)中激素濃度和靶器官受體的含量二方面而決定的。已知ER分兩個(gè)亞型，即ERα、ERβ，兩類受體有著不同的功能，研究認(rèn)為，ERα主要存在于卵囊泡膜細(xì)胞，可通過(guò)負(fù)反饋回路調(diào)節(jié)排卵［6］。我們觀察到SAMP8小鼠卵巢組織中ERαmRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，而給予何首烏飲治療后ERαmRNA和蛋白均顯著升高，提示何首烏飲可以通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢組織中的激素受體而發(fā)揮其調(diào)控內(nèi)分泌的作用。

在生理狀態(tài)下，LH、FSH共同作用，調(diào)控卵巢各種性激素的合成與分泌，促進(jìn)卵泡的正常生長(zhǎng)發(fā)育，LH的主要作用是促進(jìn)排卵和黃體形成，F(xiàn)SH的主要作用是促進(jìn)卵泡成熟及分泌雌激素，但二者均需要與相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮生物效應(yīng)［7］。其中，LHR存在于卵泡膜細(xì)胞和竇期卵泡的顆粒細(xì)胞，F(xiàn)SHR存在于竇前期卵泡和竇期卵泡的顆粒細(xì)胞。我們的結(jié)果顯示SAMP8快速老化小鼠卵巢中LHR、FSHR mRNA和蛋白表達(dá)均下降，何首烏飲能顯著提高LHR、FSHR mRNA和蛋白表達(dá)，提示何首烏飲可通過(guò)上調(diào)LHR、FSHR表達(dá)而起到促卵泡生長(zhǎng)的作用。

我們的結(jié)果顯示何首烏飲能上調(diào)ERα、LHR、FSHR的表達(dá)而起到調(diào)節(jié)調(diào)控性激素，從而達(dá)到延緩快速老化小鼠卵巢衰老的作用，可能是何首烏飲防止衰老的作用機(jī)制之一。這一問(wèn)題的闡述，有利于何首烏飲的臨床應(yīng)用和推廣。

1 張娜，李亞麗，牛嗣云，等.中藥何首烏飲抗大鼠卵巢組織衰老的機(jī)理.解剖學(xué)報(bào)，2008，39:187-191.

2 Orvieto R，Meltcer S，Liberty G，et al.Does day-3 LH/FSH ratio influence in vitro fertilization outcome in PCOSpatients undergoing controlled ovarian hyperstimulation with different GnRH-analogue?Gynecol Endocrinol，2012，28:422-444.

3 胡立君，高鳳春.綜合療法對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征患者血清雌激素的影響.中國(guó)婦幼保健，2012，27:2994-2996.

4 Miller PD.A review of the efficacy and safety of denosumab in postmenopausal women with osteoporosis.Ther Adv Musculoskelet Dis，2011，3:271-282.

5 Manrique C，Lastra G，Habibi J，et al.Loss of Estrogen Receptorα Signaling Leads to Insulin Resistance and Obesity in Young and Adult Female Mice.Cardiorenal Med，2012，2:200-210.

6 Pastore MB，Jobe SO，Ramadoss J，et al.Estrogen receptor-α and estrogen receptor-βin the uterine vascular endothelium during pregnancy:functional implications for regulating uterine blood flow.Semin Reprod Med，2012，30:46-61.

7 付靈梅，譚朝陽(yáng)，王麗君，等.紫石英對(duì)排卵障礙大鼠卵巢局部卵泡刺激素受體、黃體生成素受體表達(dá)的影響.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17:184-186.