王紅杰 張建新 解麗君 劉芳 蘇紅 蘇小華

心肌缺血再灌注損傷是多因素導(dǎo)致的病理過程，存在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑且有交互作用(cross-talk)，其中，炎性反應(yīng)貫穿于心肌缺血再灌注損傷的全過程［1］。研究表明，高血糖和氧化應(yīng)激的主要靶點是核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，并通過其調(diào)控與炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等密切相關(guān)的多種基因的表達［2］。NF-κB也存在于心肌細(xì)胞中，它的活化及其調(diào)控的一系列信號分子的表達在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用［3，4］。靜脈麻醉藥異丙酚通過抑制再灌注誘發(fā)的炎性反應(yīng)可減輕心肌缺血再灌注損傷［5］，但其對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注時炎性反應(yīng)的影響尚不明確。本研究擬通過觀察異丙酚對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注時心肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性及其下游的炎性因子的影響，探討異丙酚對糖尿病心肌保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 糖尿病模型的制備 健康雄性SD大鼠100只，體重230～280 g，隨機分為糖尿病組76只和非糖尿病組24只。禁食12 h，糖尿病組腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)55 mg/kg，72 h后剪尾尖采血測定血糖，以后每周測血糖，連續(xù)3周血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠(76只大鼠造模成功60只);非糖尿病大鼠腹腔注射等量緩沖液。

1.2 心肌缺血再灌注損傷模型制備 10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管，機械通氣，經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管，由 Powerlab/30八通道生理記錄儀同時記錄心率(HR)、平均動脈壓(MAP)。左側(cè)頸內(nèi)靜脈插管，靜脈輸注異丙酚。結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min，制成心肌缺血再灌注損傷模型。

1.3 動物分組與給藥 24只非糖尿病大鼠隨機分為假手術(shù)組(Ⅰ組)和缺血再灌注組(Ⅱ組)，60只糖尿病大鼠隨機分為假手術(shù)組(Ⅲ組)、缺血再灌注組(Ⅳ組)、異丙酚低(Ⅴ組)、中(Ⅵ組)、高(Ⅶ組)劑量組，每組12只，Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組分別從缺血前 10 min 開始持續(xù)靜脈滴注異丙酚 3、6、12 mg·kg-1·h-1，Ⅰ～Ⅳ組靜脈輸注等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.4 主要試劑與儀器 異丙酚(批號0701221，四川蜀樂藥業(yè)股份有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國)，鼠NF-κB p65單克隆抗體(美國 Santa Cruz公司)，鼠血清及組織TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒(美國R＆D公司)，SP免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司);One-Tonch血糖儀及One-Tonch血糖試紙(LifeScan公司，美國)，八通道生理記錄儀Powerlab/8s(澳大利亞 AD Instrument公司)，凝膠掃描分析系統(tǒng)BIO-PROFIF(法國VL公司)，酶標(biāo)儀Multiskan Ascent V1.24(芬蘭雷勃公司)，顯微鏡Olympus BX40(日本Olympus光學(xué)株式會社)等。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血流動力學(xué)指標(biāo):分別于缺血前、缺血30 min、再灌注120 min記錄HR、MAP，并計算血壓-心率指數(shù)(血壓×心率)。

1.5.2 血清TNF-α、IL-6含量測定:再灌注120 min后，右頸動脈取血，雙抗體夾心ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6含量。具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀450 nm處測定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中TNF-α、IL-6含量。

1.5.3 心肌組織中TNF-α、IL-6含量測定:再灌注120 min時取左心室前壁組織約100 mg，冰水浴中用0.9%氯化鈉溶液制成10%勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，雙抗體夾心ELISA法檢測心肌組織中TNF-α、IL-6含量。具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀450 nm處測定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中TNF-α、IL-6含量。

1.5.4 免疫組化染色觀察心肌組織NF-κB的表達:采用SABC(鏈酶親和素-過氧化物酶)法對心肌石蠟切片進行免疫組化染色，一抗為鼠抗NF-κB p65單克隆抗體，二抗為生物素化羊抗小鼠IgG，以0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。NF-κB p65的陽性表達呈棕黃色顆粒，位于胞漿和胞核。每張切片取10個高倍視野，計數(shù)胞核陽性表達細(xì)胞數(shù)。

1.5.5 Westernblotting檢測心肌組織NF-κB的表達:提取心肌組織核蛋白并進行Westernblotting分析，陽性區(qū)域顯深棕色。拍攝濾膜照片，并通過凝膠成像系統(tǒng)掃描，確定雜交條帶的相對灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖及體重的變化 腹腔注射STZ后72 h時Ⅲ組～Ⅶ組出現(xiàn)多飲、多食和多尿等癥狀，且隨機血糖≥16.7 mmol/L。與基礎(chǔ)值比較，腹腔注射STZ后3周時Ⅲ組～Ⅶ組隨機血糖升高，體重降低，Ⅰ組和Ⅱ組體重增加(P＜0.05或＜0.01)，隨機血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與Ⅰ組和Ⅱ組比較，腹腔注射STZ后3周時Ⅲ組～Ⅶ組隨機血糖升高，體重降低(P＜0.01)，Ⅲ組～Ⅶ組間隨機血糖和體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 7組隨機血糖及體重比較n=12，±s

表1 7組隨機血糖及體重比較n=12，±s

注:與基礎(chǔ)值比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與Ⅰ組比較，△P ＜0.01;與Ⅱ組比較，☆P ＜0.01

組別 隨機血糖(mmol/L)體重(g)基礎(chǔ)值 腹腔注射STZ后3周 基礎(chǔ)值 腹腔注射STZ后3周Ⅰ組 4.4±0.9 4.6±0.8 249±14 308±51#Ⅱ組 4.6±1.2 4.8±0.9 246±12 307±36#Ⅲ組 4.6±0.7 25.3±4.8#△☆ 254±14 223±40＊△☆Ⅳ組 4.8±0.8 24.2±5.4#△☆ 251±16 220±35＊△☆Ⅴ組 4.5±1.1 24.8±4.7#△☆ 247±13 223±26＊△☆Ⅵ組 4.4±1.0 25.1±4.2#△☆ 251±15 218±27#△☆Ⅶ組 4.7±1.3 25.3±5.1#△☆ 248±14 222±24＊△☆

2.2 血流動力學(xué)變化 缺血前糖尿病5組大鼠HR、MAP及血壓-心率指數(shù)均低于非糖尿病組(P＜0.05或＜0.01)。分別與Ⅰ組和Ⅲ組相比，缺血再灌注后Ⅱ和Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組大鼠的HR、MAP、血壓-心率指數(shù)均呈進行性下降(P＜0.01)，糖尿病各組上述指標(biāo)變化更加顯著(P＜0.05或＜0.01)。Ⅵ組和Ⅶ組在缺血再灌注120 min時HR、MAP和血壓-心率指數(shù)明顯高于Ⅳ組(P＜0.05或＜0.01)且隨劑量升高呈量效關(guān)系。見表2。

表2 7組HR、MAP和血壓-心率指數(shù)比較n=12，±s

表2 7組HR、MAP和血壓-心率指數(shù)比較n=12，±s

注:與Ⅰ組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與Ⅱ組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01;與Ⅲ組比較，▲P ＜0.01;與Ⅳ組比較，★P ＜0.05，■P ＜0.01

組別 HR(次/min) MAP(mm Hg) 心率-血壓指數(shù)(mm Hg×次/min)375±47 89.2±7.5 38.6±7.1Ⅱ組 326±46# 73.2±6.9* 26.8±2.3#Ⅲ組 324±44# 77.3±4.8 28.2±6.6Ⅳ組 253±53☆▲ 61.7±3.9☆▲ 19.1±4.6☆▲Ⅴ組 280±38 65.0±4.4 22.6±5.8Ⅵ組 292±27★ 67.4±2.7★ 25.1±4.9★Ⅶ組 314±26■ 71.4±5.0■ 26.4±3.9Ⅰ組■

2.3 血清中TNF-α、IL-6含量變化 分別與Ⅰ組和Ⅲ組相比較，Ⅱ組和Ⅳ組大鼠血清中TNF-α、IL-6含量分別明顯升高，Ⅲ組和Ⅳ組上述指標(biāo)分別明顯高于Ⅰ組和Ⅱ組，Ⅵ組和Ⅶ組TNF-α、IL-6含量明顯低于Ⅳ組(P ＜0.05或＜0.01)。見表3。

2.4 心肌組織TNF-α、IL-6含量的變化 Ⅱ組和Ⅳ組大鼠心肌組織TNF-α、IL-6含量分別明顯高于Ⅰ組和Ⅲ組，其中Ⅳ組較Ⅱ組變化顯著，與Ⅳ組比較，Ⅵ組和Ⅶ組大鼠心肌組織TNF-α含量明顯降低(P＜0.05或＜0.01)。見表3。

表3 7組血清、心肌組織TNF-α、IL-6含量的變化

2.5 心肌組織中NF-κB表達的變化 免疫組化結(jié)果顯示，Ⅰ組和Ⅲ組大鼠心肌組織中NF-κB呈低表達狀態(tài)，且陽性表達出現(xiàn)在胞漿中;而Ⅱ組和Ⅳ組NF-κB活化，表達增強，陽性顆粒出現(xiàn)在胞漿和胞核，出現(xiàn)了核移位。Ⅵ組和Ⅶ組，NF-κB表達活性較Ⅳ組低，胞核陽性表達數(shù)明顯減少(P＜0.05)，即缺血再灌注后NF-κB從細(xì)胞漿向細(xì)胞核的移位被限制。Western蛋白印跡結(jié)果顯示，Ⅰ組和Ⅲ組僅有微量的NF-κB的表達，分別與Ⅰ組和Ⅲ組比較，缺血再灌注后的Ⅱ組和Ⅳ組NF-κB表達量均顯著增加(P＜0.05或＜0.01)。Ⅵ組和Ⅶ組NF-κB的表達明顯低于Ⅳ組(P＜0.05或＜0.01)。見表4。

表4 7組心肌組織NF-κB的表達n=12，±s

表4 7組心肌組織NF-κB的表達n=12，±s

注:與Ⅰ組比較，*P ＜0.05;與Ⅱ組比較，#P ＜0.05;與Ⅲ組比較，△P ＜0.01;與Ⅳ組比較，☆P ＜0.05，▲P ＜0.01

組別 NF-κB(positive cells/hpf) NF-κB p65(relative density)1.6±0.7 1.00±0.02Ⅱ組 10.9±3.8* 3.02±0.12*Ⅲ組 5.8±1.4 1.53±0.31Ⅳ組 16.4±4.7#△ 6.02±0.52#△Ⅴ組 14.3±4.5 4.83±0.12Ⅵ組 12.6±3.6☆ 3.53±0.37☆Ⅶ組 10.3±5.3▲ 2.96±0.24Ⅰ組▲

3 討論

腹腔注射STZ是制備大鼠糖尿病模型的常用方法［6］，本研究結(jié)果顯示，腹腔注射STZ后72 h時Ⅲ組～Ⅶ組大鼠隨機血糖≥16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食和多尿等癥狀，腹腔注射STZ后3周時隨機血糖仍≥16.7 mmol/L，體重明顯降低，提示大鼠糖尿病模型制備成功。

本研究結(jié)果表明，糖尿病各組大鼠基礎(chǔ)HR、MAP及血壓-心率指數(shù)均低于非糖尿病大鼠，心肌缺血再灌注使心功能進一步下降，在缺血再灌注期間輸注6、12 mg·kg-1·h-1異丙酚改善了糖尿病大鼠心功能，說明本研究中復(fù)制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷模型可靠，異丙酚對糖尿病大鼠缺血再灌注心肌具有保護作用。

NF-κB是一個重要的多向性核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，普遍存在于真核細(xì)胞中，可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、氧化應(yīng)激相關(guān)酶等基因的表達，調(diào)控并介導(dǎo)多種病理生理過程。靜息狀態(tài)下NF-κB異源性二聚體與抑制性蛋白I-κB結(jié)合存在于胞漿中，呈無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞在一些刺激因素(如細(xì)胞因子、活性氧自由基等)作用下，I-κB發(fā)生磷酸化，隨之而產(chǎn)生泛素化，最終在蛋白酶體的作用下降解，從而釋放NF-κB二聚體，使其得以轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核中，與靶基因啟動子或增強子的κB位點發(fā)生特異性結(jié)合，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄［7］。研究表明，NF-κB是高血糖和氧化應(yīng)激時細(xì)胞內(nèi)靶點，同時，TNF-α、IL-6等參與缺血再灌注損傷的細(xì)胞因子均含有κB位點，受NF-κB的調(diào)控［8］。IL-6被認(rèn)為是一種炎性狀態(tài)的標(biāo)志，在免疫應(yīng)答與免疫細(xì)胞生長中起重要作用，而TNF-α是一種促炎性細(xì)胞因子，其主要來源于巨噬細(xì)胞豐富的肝、脾以及心肌原位巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞本身。TNF-α通過抑制心肌細(xì)胞GLUT4mRNA和蛋白質(zhì)的表達，使葡萄糖利用減少，而脂肪酸和酮體成為心肌能量的主要來源［9］。而未經(jīng)治療的糖尿病動物模型，心肌葡萄糖利用進一步下降，脂肪利用率上升至90% ～100%，使心肌 ATP水平下降近30%，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到明顯損害［10］。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ組血清TNF-α水平明顯高于Ⅰ組，而心肌TNF-α水平雖有升高趨勢，但尚無統(tǒng)計學(xué)意義，說明糖尿病是全身炎性反應(yīng)疾病，3周病程糖尿病大鼠基礎(chǔ)心功能的降低可能與全身炎性反應(yīng)所致血清TNF-α水平升高造成的心肌抑制有關(guān)。心肌缺血再灌注后，Ⅱ組和Ⅳ組血清及心肌TNF-α水平明顯均升高，說明缺血再灌注是心肌產(chǎn)生TNF-α的重要刺激因子。異丙酚中、高劑量組血清及心肌TNF-α水平明顯低于Ⅳ組，說明異丙酚能夠抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后TNF-αmRNA和蛋白表達，降低血清及心肌TNF-α水平，從而對糖尿病缺血再灌注心肌具有保護作用。

Murphy等［11］研究發(fā)現(xiàn)異丙酚結(jié)構(gòu)類似于內(nèi)源性抗氧化劑維生素E，可直接與自由基反應(yīng)生成2，6-二異丙基苯酚基團，使自由基滅活。研究證實異丙酚通過增強細(xì)胞抗氧化作用、減少自由基脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生而減輕心肌缺血再灌注損傷［12］。因此，異丙酚可能通過減少糖尿病大鼠心肌缺血再灌注時氧自由基的產(chǎn)生或抑制氧自由基的活性，降低了氧自由基對NF-κB的激活作用，減少了TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，從而具有心肌保護作用。

綜上所述，異丙酚6、12 mg·kg-1·h-1通過抑制3周病程糖尿病大鼠缺血再灌注心肌 NF-κB的激活，減少TNF-α、IL-6的釋放而具有保護作用。

1 Dandona P，Aljada A，Chaudhuri A，et al.Metabolic syndrome:a comp rehensive perspective based on interactions between obesity，diabetes，and inflammation.Circulation，2005，111:1448-1454.

2 Milne SE，Troy A，Irwin MG，et al.Relationship between bispectral index auditory evoked potential index and effect-site EC50 for propofol at two clinical end-points.Br Janaesth，2003，90:127-131.

3 Li C，Brbwder W，Kao RL.Early activation of transcription factor NF-κB during ischemia in perfused rat heart.Am J Physiol，1999，276:H543-552.

4 Elizabeth N，Morgan MD，Edward M，et al.An essential role of NF-κB in the cardioadaptive response to ischemia.Ann Thorac Surg，1999，68:377-382.

5 鄭勇萍，王焱林，王成夭，等.異丙酚預(yù)先給藥對心肌缺血再灌注損傷大鼠炎性反應(yīng)的影響.中華麻醉學(xué)雜志，2006，26:919-921.

6 張春鴻，臧偉進，徐靜，等.建立糖尿病心肌病動物模型方法的實驗研究.衛(wèi)生研究，2006，35:707-711.

7 Baeuerle PA，Henkel T.Function and activation of NF-κB in the immune system.Ann Rev Immunol，1994，12:141-179.

8 Li C，Broder W，Kao L.Early activation of transcription factor NF-kapperB during ischemia in perfused rat heart.Am J Physiol，1999，276:H543-552.

9 Grigsby RJ，Dobrowsky RT.Inhibition of ceramide production reverses TNF-a induced insulin resistance.Biochem Bioph Res Co，2001，287:1121-1124.

10 Finck BN，Han X，Courtois M，et al.Acritical role for PPA Ralpha-mediated lipotoxicity in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy:modulation by dietary fat content.PNAS，2003，100:1226-1231.

11 Murphy PG，Myers DS，Davies WJ，et al.The antioxidant potential of propofol(2，6-diisopropylphenol).Br JAnaesth，1992，68:616-618.

12 Barbara JM，Elizabeth JK，Paul S，et al.Protection of cardiomyocyte function by propofol next term during simulated ischemia is associated with a direct action to reduce pro-oxidant activity.J Mol Cell Cardiol，2007，42:600-608.