李萍 向彬 曾常茜

透骨草(Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara)為透骨草科植物的干燥全草入藥，產(chǎn)于凌源、綏中、金洲、大連等地，其化學(xué)成分為透骨草素、倍半木酚素、呋喃類等，主治黃水蒼、濕疹、跌打損傷、骨折等，具有清熱解表、活血消腫作用［1-3］。本文在其傳統(tǒng)功效的基礎(chǔ)上，觀察透骨草提取物對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響，并通過檢測(cè)透骨草提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞β-catenin和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討透骨草提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞作用的分子機(jī)制，旨在為透骨草抗肝癌作用的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，由吉林省腫瘤研究所提供;鼠抗人β-catenin、鼠抗人cyclin D1抗體購(gòu)自均購(gòu)自北京中杉金橋公司，通用型SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。RPMI 1640、小牛血清和胰蛋白酶為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;MTT和DMSO為Sigma公司產(chǎn)品;藥物采自遼寧金州大黑山，經(jīng)王心毓老先生鑒定為透骨草科植物(Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Sunrise F039300)，奧地利 Tecan公司;BB16UV型 CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)Heraeus公司。

1.2 方法

1.2.1 透骨草提取物制備方法:取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2 h，過濾，濾液水浴濃縮成干膏。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):使用RPMI 1640培養(yǎng)基，應(yīng)用時(shí)加入青霉素100 U/ml、鏈霉素100 mg/L和含10%滅活的小牛血清。人肝癌SMMC-7721細(xì)胞置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞增殖:將SMMC-7721細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液，5%CO237℃培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液制成1×107/L單細(xì)胞懸液，接種96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，5%CO237℃培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，分別加入終濃度為 6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml的透骨草提取物，每孔200μl，培養(yǎng) 72 h。每孔加入20μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入 100μl DMSO，振蕩15 min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以波長(zhǎng)570 nm測(cè)定各孔吸光度值(A)。根據(jù)如下公式計(jì)算抑制率:抑制率(%)=(1-給藥孔平均A值/對(duì)照孔平均A值)×100%。NOSA2.30軟件Bliss法計(jì)算IC50，采用透骨草提取物濃度作橫軸，抑制率作縱軸繪制曲線圖。

1.2.4 免疫組化方法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞β-catenin和cyclin D1蛋白的表達(dá):按試劑盒說明進(jìn)行操作。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1.0×105/ml細(xì)胞濃度加入培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，其中一瓶加入透骨草提取物，終濃度為40.91μg/ml(IC50)，另外一瓶加1640培養(yǎng)液，設(shè)為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)96 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，消化并收集細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞稀釋成1.0×106/ml，涂片，丙酮固定20 s，PBS沖洗2 min×3次，滴加1滴內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3 min;加1滴封閉用正常非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育15 min，棄血清，分別加1滴鼠抗人 β-catenin抗體、cyclin D1抗體，37℃孵育2 h，PBS沖洗2 min×3次。加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育15 min，PBS沖洗2 min×3次，加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗2 min×3次，加DAB底物混合工作液，鏡下觀察顯色，自來水沖洗終止顯色，再用蘇木素復(fù)染，封片，置于倒置顯微鏡下觀察。β-catenin陽性染色定位于細(xì)胞膜，cyclinD1陽性染色定位于細(xì)胞核，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透骨草提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 6.25～200μg/ml的透骨草提取物處理的SMMC-7721細(xì)胞的吸光度(A570 nm)值與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.05)，而且隨著透骨草提取物濃度的增加，A570 nm值的降低更加明顯。見表1、圖1。

表1 MTT法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞增殖的結(jié)果

2.2 透骨草提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞β-catenin和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響 未用透骨草提取物處理的對(duì)照組SMMC-7721細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)較高，細(xì)胞膜著黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)40.91μg/ml透骨草提取物處理后的SMMC-7721細(xì)胞βcatenin蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞膜著黃色的細(xì)胞量少(P＜0.05);未用透骨草提取物處理的對(duì)照組SMMC-7721細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)較高，細(xì)胞膜著黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)40.91μg/ml透骨草提取物處理后的SMMC-7721細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞核著黃色的細(xì)胞量少(P＜0.05)。見表2。

圖1 透骨草提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用

表2 免疫組化法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞β-catenin和cyclin D1蛋白表達(dá)結(jié)果%，±s

表2 免疫組化法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞β-catenin和cyclin D1蛋白表達(dá)結(jié)果%，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

-catenin cyclin D1對(duì)照組組別 β 43.6±2.1 56.2±2.4透骨草提取物處理組 16.3±1.3* 19.3±1.5△

3 討論

我們前期研究報(bào)道，透骨草提取物對(duì)人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人宮頸癌胞Hela細(xì)、人肝癌HepG-2細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，且呈一定的劑量依賴性［4］。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法首次發(fā)現(xiàn)，透骨草提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，并且呈一定的劑量依賴性。

β-catenin是一種多功能細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性蛋白，由于它在細(xì)胞黏附和增殖過程中的雙重作用，已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中的熱點(diǎn)［5］。近來研究表明，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)的累積是惡性腫瘤中的常見事件之一，在肝細(xì)胞癌中β-catenin異常表達(dá)并與肝癌發(fā)生相關(guān)［6，7］。Cyclin D1作為原癌基因，參與細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，并且與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［5］。近來研究顯示，cyclinD1是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常重要的靶基因，在肝細(xì)胞癌中異常表達(dá)［8，9］。

本實(shí)驗(yàn)用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)，40.91μg/ml透骨草提取物可使人肝癌SMMC-7721細(xì)胞β-catenin表達(dá)均下降，說明透骨草提取物可能通過下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞β-catenin和cyclin D1蛋白的表達(dá)抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果突破了透骨草傳統(tǒng)功效的范圍，發(fā)現(xiàn)了其新的藥用價(jià)值，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。有關(guān)增殖抑制的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 江蘇新醫(yī)學(xué)院主編.中藥大辭典(上冊(cè)).第1版.上海:上?？萍汲霭嫔纾?977.1878.

2 北京藥品生物制品檢定所，中國(guó)科學(xué)院植物研究所主編.中藥鑒別手冊(cè)，第1冊(cè).北京:科學(xué)技術(shù)出版社，1972.128.

3 高松主編.遼南地區(qū)藥用植物圖鑒.第1版.北京:科學(xué)出版社，2008.196.

4 曾常茜，高松，沈陽，等.透骨草提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖的影響.遼寧中醫(yī)雜志，2009，36:1952-1954.

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7 Lachenmayer A，Alsinet C，Savic R，et al.Wnt-Pathway Activation in Two Molecular Classes of Hepatocellular Carcinoma and Experimental Modulation by Sorafenib.Clin Cancer Res，2012，18:4997-5007.

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