趙森銘

(洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471023)

HPLC同時測定柴胡中黃酮和皂苷成分含量方法的改進

趙森銘*

(洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471023)

目的：改進HPLC同時測定柴胡中黃酮和皂苷含量的方法。方法：采用MERCK PUROSPHER?STAR C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.05%磷酸(梯度洗脫)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測波長為210 nm。結果：2個黃酮成分(蘆丁、槲皮素)和2個皂苷成分(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d)分別在0.36～9.09 μg(r=0.999 7)、0.47～11.70 μg(r=0.999 5)、1.15～28.66 μg(r=0.999 8)和0.66～16.46 μg(r=0.999 8)線性關系良好；平均回收率為96.39%，97.44%，100.04%，97.89%，RSD均小于1.0%。結論：本方法簡便準確、穩(wěn)定可靠，可以用于同時測定柴胡中黃酮和皂苷成分的含量。

柴胡；黃酮；皂苷；高效液相色譜法

柴胡(Bupleuri Radix)藥材來源于傘形科(Umbelliferae)植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根。上述兩個來源的植物根作為藥材按性狀不同又分別習稱為“北柴胡”和“南柴胡”[1]。柴胡作為藥材始載于《神農本草經》，列為上品，名為地薰。至《本草綱目》李時珍又名為茈胡(茈音柴)，李時珍描述茈胡：生山中，嫩苗為山菜，老而采根，名為柴胡[2]?，F代一般認為北柴胡入藥佳，療效好，被視為道地藥材[3]。臨床上柴胡最常用于治療感冒發(fā)熱。此外，柴胡也是治療瘧疾寒熱的常用之品[4]。

隨著近些年對柴胡藥效物質基礎的深入研究發(fā)現，不僅柴胡中皂苷類成分有生理活性，柴胡中黃酮和多糖成分也有重要的臨床意義[5-6]。近年來研究者逐步關注柴胡中黃酮和多糖類成分的質量控制[7]。同時測定柴胡中皂苷和黃酮成分含量有現實意義，但僅有一篇研究文獻[8]。此篇文獻采用雙波長法，分別在203 nm測定皂苷成分和360 nm測定黃酮成分，方法比較復雜。通過試驗，建立了單波長(210 nm)的HPLC法。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀(2996紫外檢測器)，MSA225S十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯)，AX200型萬分之一電子分析天平(日本島津公司)，KQ2200B超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，HH-6恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠)。

蘆丁對照品(批號：0080-9504)；槲皮素對照品(批號：100080-200707)；柴胡皂苷a對照品(批號：110777-200507)；柴胡皂苷d對照品(批號：110777-200507)；上述對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為進口色譜純，娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

柴胡樣品1(洛陽同華堂大藥房，批號：120709)；樣品2(洛陽百家好一生大藥房，批號：120102)；樣品3(洛陽開心人大藥房，批號：120305)；樣品4(洛陽市食品藥品檢驗所標本1)；樣品5(洛陽市食品藥品檢驗所標本2)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

MERCK PUROSPHER?STAR C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.05%磷酸為流動相，線性梯度洗脫0～8 min(57∶43)、8～25 min(76∶34)、25～30 min(57∶43)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為210 nm。理論板數按蘆丁峰計算應不低于3 000。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取蘆丁對照品9.09 mg，槲皮素對照品12.92 mg，柴胡皂苷a 28.66 mg，柴胡皂苷d對照品16.46 mg，分別置于50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL含蘆丁0.181 8 mg、槲皮素0.233 9 mg的混合對照品溶液和柴胡皂苷a 0.573 2 mg、柴胡皂苷d 0.329 2 mg的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取柴胡50 g，粉碎，過四號篩，精密稱取1 g置具塞150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，30 ℃水溫超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放至室溫，稱定重量，補足減失重量，濾過，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘渣加適量甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。用溶劑作為空白。精密吸取上述溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，按2.1方法測定，記錄色譜圖。結果蘆丁、槲皮素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d與相鄰成分達到基線分離。見圖1。

1.蘆丁 2.槲皮素 3.柴胡皂苷a 4.柴胡皂苷dA.蘆丁和槲皮素對照品 B.柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品 C.溶劑空白 D.柴胡樣品圖1 柴胡樣品及對照品HPLC圖

2.4 線性關系考察

分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液(蘆丁0.181 8 mg·mL-1、槲皮素0.233 9 mg·mL-1柴胡皂苷a 0.573 2 mg·mL-1、柴胡皂苷d 0.329 2 mg·mL-1)2，5，10，20，30，50 μL，按2.1色譜條件進行HPLC分析，記錄色譜圖，以各指標成分進樣量(μg)為橫坐標，以其相對應的峰面積(Y)為縱坐標，進行回歸處理，結果蘆丁回歸方程為：Y=270 795X-21 771，r=0.999 7，表明蘆丁在0.36～9.09 μg線性關系良好；槲皮素回歸方為：Y=97 421X+ 203.91，r=0.999 5，表明槲皮素在0.47～11.70 μg線性關系良好；柴胡皂苷a回歸方程為：Y=351 268X-144 127，r=0.999 8，表明柴胡皂苷a在1.15～28.66 μg線性關系良好；柴胡皂苷d回歸方程為：Y=3 230 764X+70 198，r=0.999 8，表明柴胡皂苷d在0.66～16.46 μg線性關系良好。

2.5 精密度試驗

分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液10 μL，在2.1色譜條件下各重復進樣5次，記錄峰面積，計算蘆丁、槲皮素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的RSD為0.94%，1.01%，0.33%，0.86%，說明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液10 μL，在2.1色譜條件下，在1，4，6，8，10，12 h各測定1次，記錄峰面積，分別計算蘆丁、槲皮素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的峰面積的RSD為1.29%，1.46%，1.45%，1.80%，說明供試品中溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取樣品1(批號：120709)50 g，粉碎，過四號篩，精密稱取5份樣品(1.011 8，1.017 8，1.011 5，1.012 1，1.016 6 g)，按照2.3項下操作制備供試品溶液，在2.1色譜條件下測定含量，記錄峰面積，計算蘆丁、槲皮素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的平均含量分別為1.453 7，1.712 7，5.131 4，16.614 1 mg·g-1，RSD分別為1.37%，1.25%，1.12%，1.16%，說明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取樣品1(批號：120709)50 g，粉碎，過四號篩，精密稱取5份樣，精密加入蘆丁、槲皮素混合對照品溶液5 mL，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d混合對照品溶液10 mL，按照2.3項下操作制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液各10 μL，在2.1色譜條件下進行樣品含量測定，記錄峰面積，分別計算樣品中指標成分的回收率和RSD。結果見表1。

2.9 樣品的測定

取樣品1～5各50 g，粉碎，過四號篩，每個樣品精密稱取5份，按2.3項下操作制備供試品溶液，在2.1色譜條件下測定含量，記錄峰面積，分別計算樣品1～5中指標成分的平均含量和RSD。結果見表2。

表1 回收率試驗結果

表2 柴胡樣品含量測定(n=5)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

對蘆丁、槲皮素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品溶液分別進行200～400 nm掃描，采用對照品溶液稀釋至吸光度在0.5左右進行測定，結果蘆丁在366，266，208 nm處有最大吸收，槲皮素在297，205 nm處有最大吸收，柴胡皂苷a在209 nm處有最大吸收，柴胡皂苷d在205 nm處有最大吸收。測定4種指標成分混合對照品溶液和樣品溶液，結果混合對照品溶液在290，208 nm處有最大吸收，樣品溶液在338，294，270，212 nm處有最大吸收，綜合上述情況，最終選擇210 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

流動相的選擇主要在甲醇-磷酸水系統(tǒng)和乙腈-磷酸水系統(tǒng)之間進行。綜合文獻發(fā)現甲醇-磷酸水系統(tǒng)是黃酮成分較常用的系統(tǒng)。但是在具體實驗過程中發(fā)現，乙腈-磷酸水系統(tǒng)在微調流動相比例過程中不如甲醇-磷酸水系統(tǒng)靈敏，結果選擇了甲醇-磷酸水系統(tǒng)。通過試驗調整流動相梯度洗脫比例，使各主成分與相鄰成分分離度達到1.5。結果確定流動相梯度洗脫比例為0～8 min(57∶43)、8～25 min(76∶34)、25～30 min(57∶43)。

3.3 提取溶劑和方法的選擇

在文獻[1]方法的基礎上，比較5%氨溶液-甲醇提取與甲醇提取，結果選擇甲醇提取。

3.4 樣品的測定

通過對3批市售柴胡和2批標本中蘆丁、槲皮素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 4種指標成分含量測定，表明建立的方法簡便、可靠，可以同時測定柴胡中皂苷和黃酮成分的含量，該研究為深化控制柴胡質量奠定了良好的基礎。

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ImprovementofFlavonoidsandSaponinsDeterminationinRadixBupleuribyHPLCMethod

ZHAO Sen-ming*

(LuoyangInstituteforFoodandDrugControl，Luoyang471003，China)

Objective：To detect flavonoids and saponins content in Bupleuri Radix by improved HPLC method.Methods：Using MERCK PUROSPHER?STAR C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)；the mobile phase was methanol-0.05% phosphate (gradient elution)；flow rate was 1 mL·min-1；column temperature was 35 ℃；the detection wavelength was 210nm.Results：2 flavonoids (rutin，quercetin) and 2 saponins (saikosaponin a，saikosaponin d)in 0.36-9.09 μg(r=0.999 7)，0.47-11.70 μg (r=0.999 5)，1.15-28.66 μg(r=0.999 8)and 0.66-16.46 μg(r=0.999 8)linear ranges；the average recovery rate was 96.39%，97.44%，100.04% and 97.89% respectively，all RSD<1.0%.Conclusion：This method is simple，accurate，stable and reliable，Can be used for the simultaneous determination of flavonoids and saponins in Radix Bupleuri.

Bupleurum Radix；Flavonoids；Extraction；HPLC

2013-04-01)

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趙森銘，研究方向：藥品質量控制，E-mail：71971014@qq.com