梁毓琳，李 蘭△，張遠(yuǎn)平，李云川，查 旭，戴紅梅，曹 倩，李靜華，楊文艷

（1.云南省昆明市第一人民醫(yī)院眼科 650034；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，昆明 650000）

吲哚青綠染料（indocyanine green，ICG）是一種水溶性無(wú)毒三碳菁燃料，曾廣泛應(yīng)用于眼科各類(lèi)疾病的檢查診斷中。近年來(lái)，由于后發(fā)性白內(nèi)障已成為影響白內(nèi)障患者術(shù)后擁有良好視力的主要因素，在研究后發(fā)障的實(shí)驗(yàn)中，ICG被作為一種光敏劑使用，并于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)中取得了較好的治療效果。Melendez的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ICG對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞具有光動(dòng)力毒性，并呈劑量依賴(lài)性。在近幾年對(duì)白內(nèi)障術(shù)后的后發(fā)障治療中，寄予了吲哚青綠更多的期望并加強(qiáng)了對(duì)其臨床及基礎(chǔ)方面的研究。本研究在利用ICG介導(dǎo)光動(dòng)力治療后發(fā)障實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)透射電鏡觀察視網(wǎng)膜有無(wú)損傷，了解在ICG介導(dǎo)激光治療后發(fā)障實(shí)驗(yàn)中后對(duì)視網(wǎng)膜有無(wú)不良反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只新西蘭兔，雌雄兼?zhèn)洌w質(zhì)量2.0～2.5 kg，隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 記錄儀器 重慶艾爾曦醫(yī)療器械設(shè)備有限公司生產(chǎn)的IVE 205A電生理檢查儀。

1.2.2 刺激參數(shù) 采用全視野閃光刺激器，白光刺激，刺激強(qiáng)度為1.6cd·m-2·s-1。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟 分組后的新西蘭兔，行晶狀體超聲乳化手術(shù)，術(shù)前房?jī)?nèi)注入0.5mL濃度分別為1.25mg／mL（低劑量組），2.5mg／mL（中劑量組），5mg／mL（高劑量組）的ICG后分別注入氣體，使氣體泡與角膜內(nèi)皮相接觸，隔離ICG與角膜內(nèi)皮的接觸，用810nm的半導(dǎo)體激光對(duì)囊膜進(jìn)行低能量（50 mW／cm）照射2min后完畢，沖洗出ICG，關(guān)閉切口。術(shù)后3個(gè)月，按晶狀體后囊增生混濁程度并分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：按Odrich后囊膜混濁分級(jí)法（0級(jí)為透明；l級(jí)為輕度混濁，能看清眼底或混濁面積小于1／2后囊膜面積；2級(jí)為中度混濁，能模糊看見(jiàn)眼底或混濁面積大于1／2后囊膜面積；3級(jí)為完全混濁，不能看見(jiàn)眼底。

再對(duì)兔眼行閃光視覺(jué)誘發(fā)電位檢查。在視區(qū)皮層記錄到主要成分為NPN的3相波，其中，P波的出現(xiàn)率為100%，潛伏期最穩(wěn)定，幅值也較高。故本試驗(yàn)只測(cè)量P波的潛伏期、波幅、時(shí)程。檢查方法為均選取右眼電極，所有家兔均在清醒狀態(tài)下，充分散瞳中后于暗室內(nèi)放置30min，支架固定頭部，室溫18～24℃。記錄電極刺于后枕區(qū)皮下，枕骨粗隆左右旁開(kāi)0.5 cm處，參考電極刺于乳突處皮下，接地電極刺于鼻根處［1］。檢查結(jié)束后處死動(dòng)物，取出眼球，制作透射電鏡視網(wǎng)膜標(biāo)本。最后分別觀察不同組別兔眼視網(wǎng)膜損傷情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，兔眼晶狀體后發(fā)障程度觀察結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，兔眼閃光視覺(jué)誘發(fā)電位P波采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

術(shù)后3個(gè)月，各組兔眼晶狀體后發(fā)障程度觀察結(jié)果（χ2=122.49），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 術(shù)后第3個(gè)月晶狀體后囊膜混濁情況（n=8）

圖1 視網(wǎng)膜電鏡圖片

經(jīng)閃光視覺(jué)誘發(fā)電位檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)各組兔眼閃光視覺(jué)誘發(fā)電位P波經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)潛伏期（t=0.374，r=0.033），波幅（t=2.187，r=0.251）、時(shí)程（t=1.766，r=0.566）與對(duì)照組比較均無(wú)較大差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組閃光視覺(jué)誘發(fā)電位的P波潛伏期、波幅、時(shí)程（，n=8）

表2 各組閃光視覺(jué)誘發(fā)電位的P波潛伏期、波幅、時(shí)程（，n=8）

組別 潛伏期 波幅 時(shí)程對(duì)照組113.37±15.25 8.85±1.90 68.58±7.99低劑量組 111.01±8.81 10.54±1.64 63.94±7.97中劑量組 105.13±14.22 9.60±1.57 60.01±8.59高劑量組110.64±12.33 9.75±2.31 63.07±5.39

視網(wǎng)膜透射電鏡檢查可見(jiàn)使用ICG各組兔眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)均有不同程度損傷，以神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，膜盤(pán)水腫，以及線粒體損傷較明顯，其中低劑量組兔眼視網(wǎng)膜損傷相對(duì)較輕，雙極細(xì)胞與水平細(xì)胞胞質(zhì)存在。RPE細(xì)胞層呈單細(xì)胞排列無(wú)水腫等改變，與視網(wǎng)膜神經(jīng)層黏附良好，損傷層次局限于視錐細(xì)胞層。而中劑量組及高劑量組則可見(jiàn)視網(wǎng)膜全層均有不同程度損傷。對(duì)照組視網(wǎng)膜各層未見(jiàn)損傷，見(jiàn)圖1。

3 結(jié) 論

ICG原被用于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管造影四十年，因其分子大，可與蛋白結(jié)合，對(duì)光敏感，吸收峰（805nm）與傳統(tǒng)半導(dǎo)體激光波長(zhǎng)（810nm）相近，皮膚光毒性低，組織靶向性高，生物分布和清除迅速，使用操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)使近年來(lái)其眼科用途逐漸擴(kuò)大，已廣泛用于眼底視網(wǎng)膜手術(shù)中。但目前經(jīng)臨床隨訪和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ICG在眼內(nèi)使用，無(wú)論是單獨(dú)使用或聯(lián)合光照都具有潛在的神經(jīng)毒性和視網(wǎng)膜毒性［2-3］。Rezai等［4］研究發(fā)現(xiàn)，ICG作用于RPE后明顯提高其凋亡率。Haritoglou等［5］對(duì)10例ICG染色后剝除的內(nèi)界膜用透射電子顯微鏡進(jìn)行分析顯示，視網(wǎng)膜內(nèi)界膜面有Muller細(xì)胞的損傷和細(xì)胞破裂。推測(cè)與ICG屬于高分子物質(zhì)，具有很強(qiáng)的親水性，溶解后包漿滲透提高，造成細(xì)胞水腫有關(guān)。王文瑩等［6］發(fā)現(xiàn)，ICG對(duì)體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性?？紤]為體內(nèi)多種細(xì)胞可主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)攝取ICG，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ICG濃度較高后細(xì)胞水腫。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明了ICG長(zhǎng)期存留對(duì)眼組織有潛在的危險(xiǎn)［7］。國(guó)內(nèi)何曉靜等［8］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)光動(dòng)力治療后，細(xì)胞外節(jié)段排列輕微紊亂，RPE細(xì)胞輕微內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，其內(nèi)可見(jiàn)髓樣小體?？紤]機(jī)制為當(dāng)激光作用于視網(wǎng)膜時(shí)，視網(wǎng)膜色素上皮的損傷，色素屏障受得破壞，結(jié)果提示能量能對(duì)光感受器和色素上皮起作用［9］。宋志杰等［10］在使用ICG染色視網(wǎng)膜內(nèi)界膜治療黃斑裂孔時(shí)亦發(fā)現(xiàn)其藥物毒性與劑量呈相關(guān)，并隨隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜水腫能夠逐漸減輕。李雁杰等［11］研究亦發(fā)現(xiàn)無(wú)論是低濃度還是高濃度的ICG直接用于都會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜造成損傷。

本實(shí)驗(yàn)中ICG雖不直接作用于眼底，但藥物滯留于后囊膜3個(gè)月，通過(guò)緩慢代謝，可能有部分ICG彌散到玻璃體腔及視網(wǎng)膜前造成損害，并可能隨濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞毒性作用逐漸增強(qiáng)。為了解ICG引導(dǎo)光動(dòng)力治療后發(fā)障后是否也存在對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的毒性作用，從而更加全面評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)的治療價(jià)值和不良反應(yīng)，對(duì)不同藥物濃度組別分別觀察視網(wǎng)膜電鏡結(jié)果，同時(shí)行閃光視覺(jué)誘發(fā)電位檢查。本實(shí)驗(yàn)設(shè)立了手術(shù)對(duì)照組，目的是為了了解手術(shù)是否會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜造成損傷。手術(shù)對(duì)照組術(shù)后3個(gè)月電鏡顯示視網(wǎng)膜各層排列整齊、層次清晰，與正常兔眼視網(wǎng)膜電鏡圖片對(duì)比未見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)改變。說(shuō)明該手術(shù)對(duì)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。

本實(shí)驗(yàn)表明，利用ICG介導(dǎo)的光動(dòng)力作用在治療兔眼后發(fā)障有效的同時(shí)，因ICG緩慢的彌散至玻璃體腔，不同濃度的ICG組均能對(duì)視網(wǎng)膜造成損傷，并呈劑量相關(guān)。低劑量組損傷較輕，高劑量組則損傷相對(duì)增多，在本實(shí)驗(yàn)中以濃度為1.25 mg／mL ICG治療時(shí)損傷最少。結(jié)果與各類(lèi)實(shí)驗(yàn)中將ICG直接用于視網(wǎng)膜前結(jié)果類(lèi)似。同時(shí)實(shí)驗(yàn)各組未造成RPE的脫離及細(xì)胞凋亡，閃光視覺(jué)誘發(fā)電位與對(duì)照組P波潛伏期，波幅及時(shí)程比較均無(wú)明顯差異，且與正常兔眼閃光視覺(jué)誘發(fā)電位實(shí)驗(yàn)值較為接近［12］?？煽紤]今后在進(jìn)一步利用ICG介導(dǎo)光動(dòng)力防治晶狀體后發(fā)障時(shí)，采用低濃度組治療，以在取得治療效果的同時(shí)將視網(wǎng)膜損傷降為最低。

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