周陽明，衛(wèi)光曦，倪 靈，萬朝霞

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科 401147；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科 400015）

牙周炎（periodontitis）是人類最常見的口腔感染性疾病之一，是造成牙槽骨吸收、牙松動(dòng)脫落的主要原因，對(duì)口腔組織的健康有很大的危害。大量研究發(fā)現(xiàn)，牙周微生物在牙周病的發(fā)病中是必需的始動(dòng)因素，但單純的細(xì)菌因素不足以解釋疾病的復(fù)雜性和嚴(yán)重性。易感的宿主及某些能增加宿主易感性的因素是影響牙周病發(fā)生、發(fā)展和對(duì)治療反應(yīng)的重要因素［1］。應(yīng)激指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)所處的一種狀態(tài)，此狀態(tài)的基礎(chǔ)是體內(nèi)出現(xiàn)一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)［2-4］。許多心理免疫學(xué)和流行病學(xué)研究證實(shí)，免疫系統(tǒng)作為牙周病的調(diào)節(jié)因素，可被心理應(yīng)激反應(yīng)通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)影響并調(diào)節(jié)牙周炎的發(fā)生［5-6］。

本研究擬通過建立大鼠應(yīng)激牙周炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討限制性應(yīng)激在實(shí)驗(yàn)性牙周炎發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，從而為進(jìn)一步闡明應(yīng)激在牙周炎發(fā)生過程中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型 清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，6周齡，體質(zhì)量160～180g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。無特殊致病菌的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。這項(xiàng)研究中所有大鼠的處理得到中國重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立：參照Kimura等［7］的方法，選定大鼠左上頜第一磨牙為實(shí)驗(yàn)牙，在其頸部用浸有牙周致病菌的0.012mm不銹鋼結(jié)扎絲進(jìn)行結(jié)扎，并使結(jié)扎絲盡量位于齦溝內(nèi)，結(jié)扎絲在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中一直保留作為口腔微生物的滯留裝置（圖1）。右上頜第一磨牙不做任何處理，作為陰性對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 結(jié)扎后隨機(jī)分為應(yīng)激組和非應(yīng)激組，每組分2個(gè)亞組，各12只?？瞻捉M（G1組）：非應(yīng)激大鼠右上頜第一磨牙；單純性牙周炎組（G2組）：非應(yīng)激大鼠左上頜第一磨牙；限制性應(yīng)激組（G3組）：應(yīng)激大鼠右上頜第一磨牙；限制性應(yīng)激＋牙周炎組（G4組）：應(yīng)激大鼠左上頜第一磨牙。應(yīng)激刺激方案執(zhí)行后第2、3、4、5周，在應(yīng)激大鼠和非應(yīng)激大鼠中隨機(jī)處死6只。

1.3 牙齦指數(shù)的測(cè)量 參照文獻(xiàn)［8］報(bào)道對(duì)牙齦情況進(jìn)行分級(jí)。0表示牙齦健康；1表示牙齦輕度炎癥：牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2表示牙齦中等炎癥：牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3表示牙齦嚴(yán)重炎癥：牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動(dòng)出血傾向。栓絲后1、2、3、4周后，使用鈍頭牙周探針檢查大鼠牙周情況，探診檢查實(shí)驗(yàn)牙牙齦的頰側(cè)中部、頰側(cè)遠(yuǎn)中和腭側(cè)中部、腭側(cè)遠(yuǎn)中，這4個(gè)點(diǎn)的均值代表該牙的分?jǐn)?shù)。

圖1 結(jié)扎左上頜第一磨牙

1.4 應(yīng)激刺激方案 牙周炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立成功后，隨機(jī)選取24只大鼠進(jìn)行限制性應(yīng)激刺激：將大鼠用自制的大鼠制動(dòng)器（圖2）固定身體，動(dòng)物不能隨意移動(dòng)，不能進(jìn)食，可以進(jìn)水，每天制動(dòng)12h。

圖2 大鼠制動(dòng)器

1.5 促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)酮（CORT）的測(cè)定各組大鼠處死前于非麻醉狀態(tài)下取尾部末梢血0.5mL置于肝素抗凝管，冰凍保存待測(cè)；麻醉后心臟穿刺取血2mL置于肝素抗凝管，37℃恒溫水浴2h，3 000r／min離心20min，取上清液（血漿），冰凍保存待測(cè)；將血液和血漿標(biāo)本采用放射免疫分析法分別測(cè)定ACTH、CORT。

1.6 檢測(cè)牙槽骨喪失程度（AL） 各組大鼠處死后取上頜骨，去凈軟組織，用1%亞甲基藍(lán)液顯示牙槽嵴頂?shù)奈恢?。測(cè)量上頜第一磨牙頰側(cè)中部、頰側(cè)遠(yuǎn)中、腭側(cè)中部、腭側(cè)遠(yuǎn)中的釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂?shù)木嚯x，這4個(gè)位點(diǎn)測(cè)量值的均值作為該牙的AL。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠牙周炎動(dòng)物模型牙齦指數(shù) 在各個(gè)時(shí)間段，牙周結(jié)扎側(cè)牙齦指數(shù)明顯高于未結(jié)扎側(cè)（P＜0.01）。證實(shí)牙周結(jié)扎能造成大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎，見表1。

表1 牙齦指數(shù)（）

表1 牙齦指數(shù)（）

＊：P＜0.01，與牙周未結(jié)扎側(cè)比較。

組別 第1周 第2周 第3周 第4周牙周未結(jié)扎側(cè)0.33±0.11 0.44±0.14 0.41±0.21 0.38±0.17牙周結(jié)扎側(cè) 0.64±0.14＊1.22±0.22＊1.76±0.25＊2.38±0.17＊

2.2 ACTH和CORT檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)激組大鼠體內(nèi)的ACTH和CORT水平明顯高于同時(shí)期非應(yīng)激組大鼠（P＜0.01），見表2。在前3周，應(yīng)激組大鼠ACTH水平呈遞增趨勢(shì)，但第5周ACTH水平含量較第4周有所下降。從第2周開始，應(yīng)激組大鼠CORT含量逐漸增高，并且第5周應(yīng)激組大鼠CORT含量與非應(yīng)激組相比差距最明顯（P＜0.01），見表3。

表2 ACTH含量比較（，pg／mL）

表2 ACTH含量比較（，pg／mL）

＊：P＜0.01，與非應(yīng)激組比較。

組別 第2周 第3周 第4周 第5周非應(yīng)激組 40.62±6.98 46.18±9.80 46.12±8.84 49.62±4.40應(yīng)激組 66.72±7.08＊91.44±4.59＊96.48±14.01＊85.94±5.99＊

表3 CORT含量比較（，pg／mL）

表3 CORT含量比較（，pg／mL）

＊：P＜0.01，與非應(yīng)激組比較。

分組 第2周 第3周 第4周 第5周非應(yīng)激組 207.38±19.49 217.76±52.28 215.90±11.01 241.62±32.83應(yīng)激組 370.18±28.15＊347.88±40.33＊383.10±31.58＊411.66±9.78＊

2.3 AL檢測(cè)結(jié)果 通過對(duì)G1組和G2組大鼠上頜第一磨牙AL的比較可以發(fā)現(xiàn)，栓絲后的G2組大鼠的AL均高于未栓絲的G1組大鼠（P＜0.01）。從第2周開始，AL逐漸增高，證明牙周炎大鼠的模型建立成功。與G2組比較，在給予限制性應(yīng)激處理后的G4組大鼠的AL均明顯高于在同一時(shí)間檢查的G2組大鼠（P＜0.01），并且第5周兩組間差距最大。通過對(duì)G4組大鼠不同時(shí)間內(nèi)檢測(cè)的AL數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，從第2周開始，隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，AL也會(huì)有所增加（P＜0.01）。G1組和G3組之間沒有明顯差異（P＞0.05），見表4。

表4 各組AL檢測(cè)結(jié)果（，mm）

表4 各組AL檢測(cè)結(jié)果（，mm）

組別 第2周 第3周 第4周 第5周G1組0.06±0.02 0.07±0.02 0.08±0.04 0.10±0.05 G2組 0.83±0.14 1.06±0.20 1.17±0.19 1.42±0.26 G3組 0.08±0.05 0.10±0.04 0.07±0.05 0.09±0.04 G4組1.90±0.14 2.39±0.22 2.68±0.19 2.98±0.22

3 討 論

3.1 模型建立的評(píng)價(jià) 國外有研究結(jié)果證明，大鼠是嚙齒類動(dòng)物，其牙槽骨、牙齦及牙周組織學(xué)特征與人類相似，適合作為牙周炎動(dòng)物模型。SD大鼠的生物學(xué)特性還包含：（1）是晝伏夜動(dòng)雜食動(dòng)物；（2）喜啃咬，性情較溫順，抗病力強(qiáng)；（3）大鼠汗腺不發(fā)達(dá)；（4）嗅覺靈敏；（5）對(duì)噪聲敏感；（6）垂體、腎上腺功能發(fā)達(dá)，應(yīng)激反應(yīng)敏感，行為表現(xiàn)多樣等?；谏鲜鲞@些特性，SD大鼠非常適合建立牙周炎應(yīng)激模型［9］。牙頸部結(jié)扎是誘發(fā)大鼠牙周炎的傳統(tǒng)方法，通過結(jié)扎促進(jìn)局部菌斑、牙石堆積形成，從而引發(fā)牙周組織的破壞，已是一種較成熟的方法。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠結(jié)扎側(cè)和未結(jié)扎側(cè)牙齦指數(shù)及AL結(jié)果的對(duì)比可以證明，牙頸部結(jié)扎可以有效導(dǎo)致大鼠結(jié)扎區(qū)牙周炎的發(fā)生。

3.2 限制性應(yīng)激牙周炎的影響 任何軀體或心理的刺激，只要達(dá)到一定強(qiáng)度，除了引起與刺激因素直接相關(guān)的特異性變化外，還可以引起一組與刺激因素非直接關(guān)系的全身非特異反應(yīng)，這種反應(yīng)就是應(yīng)激。關(guān)于應(yīng)激對(duì)牙周炎影響的臨床研究已有很多報(bào)道，但基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究不多，尤其是在國內(nèi)，很少有相關(guān)研究。

從目前的研究結(jié)果可以得知，應(yīng)激反應(yīng)通過神經(jīng)和神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的途徑至少有3條［10-12］。（1）下丘腦-下垂體-腎上腺素（HPA）軸：應(yīng)激使HPA加強(qiáng)了促進(jìn)促進(jìn)腦垂體分泌ACTH，從而使糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生并釋放進(jìn)入體循環(huán)［13］。糖皮質(zhì)激素的增多不僅使血糖升高，并且抑制從Th1到Th2的炎癥反應(yīng)。（2）交感神經(jīng)系統(tǒng)：應(yīng)激激活了支配免疫系統(tǒng)的交感神經(jīng)纖維，釋放兒茶酚胺導(dǎo)致腎上腺分泌去甲腎上腺素和腎上腺素。（3）感覺肽能神經(jīng)途徑：應(yīng)激促進(jìn)感覺神經(jīng)纖維釋放P物質(zhì)、生長(zhǎng)激素抑制素及神經(jīng)生長(zhǎng)因子等神經(jīng)肽，從而介導(dǎo)神經(jīng)源性的炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的活性和細(xì)胞素的釋放。因此，應(yīng)激可以通過這3條途徑對(duì)牙周病發(fā)揮各種不同的作用。在以往的國內(nèi)外研究中［14-15］，嘗試構(gòu)建心理應(yīng)激的方式有很多，如冰敷法、減尾法、高溫刺激等不同方式來嘗試使實(shí)驗(yàn)樣本產(chǎn)生并達(dá)到預(yù)期的心理應(yīng)激反應(yīng)。但是，通過制動(dòng)來引發(fā)的限制性應(yīng)激在強(qiáng)度、頻率、持續(xù)的時(shí)間等方面便于控制，所以目前被國內(nèi)外廣大學(xué)者所采納。

本實(shí)驗(yàn)所采用的制動(dòng)器是根據(jù)限制性應(yīng)激所需要的條件自制的一個(gè)制動(dòng)器。它在不會(huì)過分加壓的情況下，可以限制大鼠的自由活動(dòng)（力量可以調(diào)節(jié)），同時(shí)不會(huì)影響到大鼠呼吸和進(jìn)水。在將大鼠從制動(dòng)器放回籠中后方便對(duì)其進(jìn)行沖洗保持里面環(huán)境的清潔，完全符合限制性應(yīng)激制動(dòng)的要求。ACTH和CORT是提示機(jī)體是否發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的最重要、最經(jīng)典的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)大鼠牙周炎模型加入限制性應(yīng)激后，檢測(cè)出大鼠體內(nèi)應(yīng)激指標(biāo)ACTH和CORT含量在應(yīng)激組均增高，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)應(yīng)激刺激發(fā)生了反應(yīng)，證明應(yīng)激牙周炎動(dòng)物模型建立成功。再通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)中各組AL的測(cè)量和比較，可以發(fā)現(xiàn)在加入限制性應(yīng)激這一條件后，應(yīng)激組大鼠結(jié)扎側(cè)AL明顯高于非應(yīng)激組大鼠結(jié)扎側(cè)AL，說明限制性應(yīng)激會(huì)加重已發(fā)生牙周炎的大鼠牙周組織的牙槽骨吸收，而應(yīng)激組大鼠未結(jié)扎側(cè)AL與非應(yīng)激組大鼠未結(jié)扎側(cè)AL無明顯差異，這說明應(yīng)激這一因素對(duì)未發(fā)生牙周炎的大鼠牙周組織沒有影響。通過對(duì)應(yīng)激組大鼠結(jié)扎側(cè)前4周的AL進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，AL也會(huì)增加，證明應(yīng)激時(shí)間的長(zhǎng)短與大鼠牙周組織的AL呈正相關(guān)。而應(yīng)激加重牙周炎的原因可能在于在應(yīng)激狀態(tài)下，宿主的免疫機(jī)制發(fā)生改變，各種炎癥介質(zhì)釋放增加，使得宿主對(duì)局部菌斑等不良刺激更加敏感，從而加重了炎癥進(jìn)程。

很顯然，大鼠適合用牙頸部結(jié)扎的方法建立限制性牙周炎模型來研究應(yīng)激與牙周炎的關(guān)系。應(yīng)激對(duì)沒有發(fā)生牙周炎的牙周組織無任何影響，但對(duì)已發(fā)生了牙周炎的牙槽骨吸收有促進(jìn)作用，可以加重牙周炎的發(fā)展。隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，牙槽骨的吸收程度也會(huì)加重。但是，目前關(guān)于應(yīng)激與牙周組織炎癥的聯(lián)系在分子生物學(xué)水平上的解釋仍然是模糊不清的，還需對(duì)其進(jìn)行更加深入的研究。

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