高俊峰，高忠燕，王麗坤，張顯光，崔宇超，侯美如

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾161005；2.扎龍國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，黑龍江齊齊哈爾161002)

枝雙腔吸蟲(Dicrocoelium dendriticum)屬于雙腔科(Dicrocoeliidae)雙腔屬(Dicrocoelium)，是一種食源性人獸共患寄生蟲病原，主要寄生于終末宿主的膽囊和膽管，引起雙腔吸蟲病，宿主呈漸進(jìn)性消瘦和消化不良，進(jìn)而造成肉和奶的產(chǎn)量下降以及幼畜的死亡[1]。枝雙腔吸蟲的終末宿主范圍比較廣泛，主要感染牛和羊，此外，兔子、貓、狗、豬、馬和人也可感染，一些野生動物如鹿、駱駝、羊駝也有感染枝雙腔吸蟲的報道[2-3]。因此，枝雙腔吸蟲不僅給畜牧產(chǎn)業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失，對人類和野生動物的生命健康也具有一定的威脅。

國內(nèi)關(guān)于枝雙腔吸蟲的報道極少，僅在青海高原[4]和黑龍江省牡丹江地區(qū)[5]有枝雙腔吸蟲的報道，而且主要集中于流行病學(xué)調(diào)查和形態(tài)學(xué)鑒定，這可能與形態(tài)學(xué)鑒定困難，容易造成誤判有關(guān)。雙腔吸蟲屬的枝雙腔吸蟲、中華雙腔吸蟲和矛形雙腔吸蟲在形態(tài)學(xué)上較為相似，并且均可以感染羊[6]，這給鑒別檢測帶來了一定的難度。核糖體DNA (rDNA)作為一個實用的分類工具，能夠顯示出不同寄生蟲之間的種內(nèi)差異和種間差異，其中，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer region，ITS)序列可作為較好的基因標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于寄生蟲的遺傳進(jìn)化分析[7]。因此，本研究擬對齊齊哈爾地區(qū)綿羊膽管中分離的吸蟲通過形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，并基于ITS-2 序列進(jìn)行分子進(jìn)化研究，為雙腔吸蟲的流行病學(xué)調(diào)查和分子鑒別診斷提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲 體 2017 年8 月，于黑龍江省齊齊哈爾市周邊某羊場剖檢病死成年綿羊，于膽管中收集到大量新鮮蟲體，經(jīng)生理鹽水沖洗后，保存于70 %乙醇中固定備用。

1.2 主要試劑 蘇木素染液購自Biosharp 公司；Tissue DNA Kit 購自O(shè)MEGA bio-tek 公司；ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker、pMD18-T 載體均購自寶生物工程(大連)有限公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.3 吸蟲的形態(tài)學(xué)鑒定 采用蘇木素染色法[8]將乙醇固定的蟲體染色后制作成裝片，于顯微鏡下觀察，記錄蟲體形態(tài)，根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定要點(diǎn)進(jìn)行鑒定。

1.4 rDNA ITS 基因序列的PCR 擴(kuò)增及分析 取5條成蟲樣品，分別置于無菌離心管中，利用DNA提取試劑盒提取蟲體總DNA，提取的DNA 樣品放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以提取的DNA 為模板，利用通用引物NC5：5'-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3'/NC2：5'-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3'，PCR 擴(kuò)增ITS 基因序列。反應(yīng)體系為25 μL；反應(yīng)條件為：92 ℃2 min；92 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃1 min 20 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收。純化后連接于pMD18-T 載體中，轉(zhuǎn)化至DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，篩選陽性重組菌，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR 鑒定后，陽性質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司雙向測序。利用生物學(xué)軟件DNAStar，參照NCBI 中相關(guān)吸蟲ITS 序列，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，確定ITS 各段的大小，將ITS-1 和ITS-2 序列拼接，與NCBI 中同源性最高的吸蟲ITS 序列進(jìn)行比對分析。

將獲得吸蟲的ITS-2 基因序列與NCBI 中相關(guān)序列進(jìn)行比對分析，以斜睪目背孔科背孔屬Notocotylus malhamensis(JQ766940)作為外群，利用Clustal X 1.83 和MEGA 5.1 軟件繪制遺傳進(jìn)化樹，探究本研究分離吸蟲的系統(tǒng)發(fā)生位置。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸蟲的形態(tài)學(xué)鑒定 采用蘇木素染色法將蟲體染色后制作成裝片經(jīng)顯微鏡觀察，結(jié)果顯示本研究的蟲體形態(tài)與文獻(xiàn)[6]中枝雙腔吸蟲的描述一致，蟲體呈肩紡錘形。有口、腹吸盤，從腹吸盤到蟲體后端，蟲體的寬度幾乎一致。兩睪丸在腹吸盤后呈斜列排布，睪丸分瓣，從睪丸引出的小輸精管在腹吸盤上會合后伸進(jìn)陰莖囊，陰莖囊大而發(fā)達(dá)，與子宮末端共同開口于腸分叉處后方。卵巢位于睪丸后方，成塊狀。兩束卵黃腺呈細(xì)枝條狀，分布于蟲體兩側(cè)。子宮較為發(fā)達(dá)，由許多上行和下行的子宮圈組成，幾乎充滿生殖腺與腸管之間的全部縫隙(圖1)。該結(jié)果表明本研究分離的吸蟲在形態(tài)學(xué)上鑒定為枝雙腔吸蟲。

枝雙腔吸蟲與中華雙腔吸蟲、矛形雙腔吸蟲同屬于雙腔科雙腔屬，終末宿主主要為反芻動物。它們在形態(tài)學(xué)上較為相似，唐崇惕等[6]描述3 種雙腔吸蟲形態(tài)和睪丸的排列方式存在差異，枝雙腔吸蟲蟲體形態(tài)呈紡錘形或橢圓形，睪丸呈分支斜列；中華雙腔吸蟲蟲體形態(tài)呈紡錘形，睪丸呈并列狀；矛形雙腔吸蟲蟲體呈長矛形，睪丸呈團(tuán)塊狀前后排列。本研究分離的雙腔吸蟲參照以上鑒定要點(diǎn)初步鑒定為枝雙腔吸蟲。然而，Otranto 等報道的枝雙腔吸蟲蟲體呈長矛形，睪丸排列方式為前后排列，分子生物學(xué)鑒定同樣為枝雙腔吸蟲[9]；Fakhar 等報道的枝雙腔吸蟲蟲體呈紡錘形，睪丸為前后排列[10]。蟲體的形態(tài)可能受諸多因素影響，如：蟲體的壽命、營養(yǎng)條件、感染程度、地理分布、不同的發(fā)育階段、檢測方法、時間和地點(diǎn)等，因此，僅憑傳統(tǒng)方法鑒定形態(tài)上相似的吸蟲有一定的困難，為更確切了解本研究分離吸蟲的分類地位，需要從分子水平上做進(jìn)一步鑒定。

圖1 枝雙腔吸蟲形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology of the trematode isolated in this study

2.2 rDNA ITS 基因序列的擴(kuò)增及分析 利用通用引物擴(kuò)增5 條吸蟲的rDNA ITS 序列，產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增的條帶均出現(xiàn)在約1 000 bp 的位置，與預(yù)期目的片段一致，且無非特異性條帶。基因片段經(jīng)測序后經(jīng)人工校正，得到完整的ITS 序列，5 條蟲體的ITS 序列完全一致，全長為1 144 bp，通過與NCBI 中其它ITS 基因序列比對分析得出ITS-1，5.8s 和ITS-2 大小分別為749 bp，161 bp 和234 bp。將獲得的ITS-1 和ITS-2 基因序列拼接后與NCBI 中枝雙腔吸蟲(KC774522)的ITS-1 和ITS-2 拼接序列進(jìn)行比對分析，二者同源性可達(dá)99.8 %，ITS 全基因序列中存在兩處突變，分別為ITS-1 區(qū)域的C87T 和ITS-2 區(qū)域的A763G。該結(jié)果表明本研究分離的吸蟲在分子水平上也鑒定為枝雙腔吸蟲。

2.3 雙腔科吸蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析 本研究利用ITS-2基因序列作為基因標(biāo)記構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Notocotylus malhamensis作為外群，與雙腔科吸蟲明顯處于兩個不同的分支。本研究分離的吸蟲與枝雙腔吸蟲聚集在一起，種內(nèi)差異率為0～0.9 %。所有的枝雙腔吸蟲與雙腔屬的另外兩種吸蟲中華雙腔吸蟲、東方雙腔吸蟲聚集在一個大分支里，而與同為雙腔屬的牛雙腔吸蟲遺傳距離稍遠(yuǎn)，本研究分離的吸蟲與雙腔屬的其它吸蟲種間差異率為3.4 %～11.4 %，種間差異明顯大于種內(nèi)差異。雙腔屬、短腺屬和饒氏屬的吸蟲聚集在一個更大分支內(nèi)，扁體屬和闊盤屬聚集在另一個大分支內(nèi)，本研究分離的吸蟲與雙腔科其它屬吸蟲差異率為6.9 %～23.1 %，差異更為明顯(圖2)。這表明ITS-2 基因序列種內(nèi)變異很小，種間差異明顯，ITS-2 也適合作為吸蟲的遺傳標(biāo)尺。

本研究進(jìn)化樹選擇來自于不同地區(qū)和不同宿主的枝雙腔吸蟲的ITS-2 基因序列，地域上主要為歐洲和亞洲地區(qū)，宿主包括家養(yǎng)動物和野生動物，進(jìn)化樹顯示不同來源的ITS-2 基因序列差異不大，可能是因為枝雙腔吸蟲種群內(nèi)存在基因穩(wěn)定性，這種基因穩(wěn)定性已被證明存在于其它同樣是宿主和地域來源均廣泛的寄生蟲種群內(nèi)[11]。中華雙腔吸蟲和東方雙腔吸蟲聚集在一個小分支中，這與Bian[1]等的報道結(jié)果相一致，表明這兩種吸蟲很可能為同一個種。而雙腔屬中牛雙腔吸蟲與其它吸蟲遺傳距離稍遠(yuǎn)，與短腺屬分離自歐亞鴝的吸蟲處于同一個分支，雖然牛雙腔吸蟲宿主來源也為反芻動物，但依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和宿主進(jìn)行種屬分類可能存在一定的缺陷，由于數(shù)據(jù)有限，這一推斷還有待于進(jìn)一步驗證。

本研究通過對黑龍江省齊齊哈爾地區(qū)綿羊體內(nèi)分離的吸蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，最終確定所分離的吸蟲為枝雙腔吸蟲，該結(jié)果為齊齊哈爾地區(qū)雙腔吸蟲流行病學(xué)調(diào)查及分子鑒別診斷提供科學(xué)的參考依據(jù)。

圖2 分離的雙腔科吸蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Dicrocoeliidae trematode