鄧志成， 陳 勝， 劉雙海

冬凌草甲素(oridonin)是我國自行研制的一種抗腫瘤藥物，是從唇形香茶屬植物冬凌草中提取的一種以貝殼杉烯為骨架的四環(huán)二萜類化合物。已有研究證實(shí)冬凌草甲素對肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種細(xì)胞株均具有明顯的體外抑制作用［1］，也有研究證實(shí)，冬凌草甲素對多種移植性腫瘤具有明顯的抑制作用，其對實(shí)體瘤的治療作用目前也已廣泛地應(yīng)用于臨床，常用于食管癌、胃癌等腫瘤的治療，且已取得明顯的臨床療效［2-3］。為了探討冬凌草甲素在肝癌中的療效及其作用機(jī)制，本研究以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721為研究對象，通過檢測Survivin、Bcl-2、Bax蛋白和 Survivin、Bcl-2、Bax mRNA 表達(dá)的變化，觀察不同濃度的冬凌草甲素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，探討冬凌草甲素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，為冬凌草甲素應(yīng)用于臨床治療肝癌提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株為人肝癌SMMC-7721，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;冬凌草甲素購自南京澤朗生物科技有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司;10%新生小牛血清購于杭州四季青生物工程研究所;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Sigma公司;鼠抗人Bcl-2、Bax、Survivin單抗購于碧云天生物技術(shù)研究所。Air Tech超凈實(shí)驗(yàn)臺(蘇州凈化設(shè)備儀器廠);BB5060型CO2孵育箱(德國Heraeus);倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);紫外分光光度計(jì)(美國Beckman Coulter公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(華東電子集團(tuán)醫(yī)療設(shè)備裝備有限公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國Viber Lourmat);9600型PCR擴(kuò)增儀(美國 ABI公司);power PAC 2000型蛋白核酸定量儀(美國Bio-Rad公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞株復(fù)蘇后懸浮生長于RPMI 1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%小牛血清、1 mmol/L谷胺酰胺及青、鏈霉素各100 U/L。于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于含冬凌草甲素濃度分別為 5、10、20、30、40 μmol/L 的培養(yǎng)體系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞終濃度調(diào)至2×105/L。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞生存率 取對數(shù)生長期的人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞，0.25% 胰酶(含 0.02%EDTA)消化后，用1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待24 h細(xì)胞完全貼壁后，更換新的培養(yǎng)基，分別加入含冬凌草甲素濃度為 5、10、20、30、40 μmol/L，共同培養(yǎng)12、24、48、60、72 h 并設(shè)立加培養(yǎng)基不加藥物的陰性對照組，每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔(空白培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，繼續(xù)在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在加藥后的 12、24、48、60、72 h 時(shí)取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，37℃孵育4 h后，陰性對照組中已形成明顯的藍(lán)紫色顆粒結(jié)晶時(shí)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL DMSO，將培養(yǎng)板放在平板搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm波長處的每孔吸光度值(A值)，算出各藥物濃度6個(gè)復(fù)孔的平均值，根據(jù)公式:抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值)×100%，計(jì)算不同濃度、時(shí)間下冬凌草甲素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長的抑制率，平均抑制數(shù)據(jù)以x±s表示，以Excel軟件繪制曲線。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 按培養(yǎng)條件，將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁良好，處于對數(shù)生長期時(shí)，分別以不同濃度冬凌草甲素作用48 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.4 RT-PCR 半定量檢測 Survivin、Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá) 提取10、20、30、40 μmol/L 濃度組冬凌草甲素及對照組作用48 h后的SMMC-7721細(xì)胞2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，等量取cDNA，用相對應(yīng)的引物對基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由上海生工有限公司合成并經(jīng)質(zhì)量檢測，開蓋前瞬時(shí)離心，加入TE(pH 8.0)稀釋至濃度為10 μM，－20℃儲存?zhèn)溆?，PCR循環(huán)程序:GAPDH變性94℃，1 min，退火溫度53℃，2 min，延伸 72 ℃，3 min，循環(huán)次數(shù) 30;Survivin和Bcl-2變性94℃，45 s，退火溫度61℃，時(shí)間1 min，延伸72℃，1 min，循環(huán)次數(shù)40;Bax變性94℃，45 s，退火溫度 58℃，時(shí)間 1 min，延伸72 ℃，1 min，循環(huán)次數(shù)40;10 min結(jié)束反應(yīng)。取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液混合，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠，以電壓100 V，在 1×TAE緩沖液中電泳30 min分離片段。所有RT-PCR均進(jìn)行3次。試驗(yàn)電泳后凝膠條帶經(jīng)Genesnap成像后用Genetool行半定量分析，結(jié)果用各個(gè)基因擴(kuò)增條帶的灰度值與內(nèi)參照GAPDH的灰度值的比值表示。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段

2.5 Western Blot法檢測 Survivin、Bax、Bcl-2 的蛋白水平 給予10、20、30、40 μmol/L冬凌草甲素作用48 h后離心收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗2次，按5×105個(gè)細(xì)胞加入50～60 μL裂解液的比例加入細(xì)胞裂解液，超聲細(xì)胞破碎儀低溫超聲裂解細(xì)胞，4℃、10 000 rpm離心10 min，分裝上清，－70℃保存，用10%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)到偏聚氟二乙烯PVDF膜上，加入1∶1 000單抗2 h后 PBS和 TBST各洗2次，1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG孵育1 h，TBST洗2次，應(yīng)用ECL Western Blotting檢測系統(tǒng)測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以x±s及百分率(%)表示，使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)、SNK兩兩比較法，以 P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MTT比色法測定冬凌草甲素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用 不同濃度的冬凌草甲素(10、20、30、40 μmol/L) 均可抑制人 肝 癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞生長，且隨濃度升高和作用時(shí)間延長，作用逐漸增強(qiáng);40 μmol/L冬凌草甲素引起的生長抑制率明顯高于其他濃度組的抑制率，5 μmol/L冬凌草甲素對細(xì)胞的增長無明顯抑制作用(P＞0.05)，其他各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。不同時(shí)間組(12、24、48、60、72 h)間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通過測量吸光度值計(jì)算細(xì)胞生長抑制率并繪制生長抑制曲線圖(圖1)。

3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 藥物作用后細(xì)胞的體積、形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯的變化，隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的死亡數(shù)量增加，顯微鏡下可見大量的細(xì)胞碎片。部分細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)開始濃縮并逐漸形成塊狀，有些染色質(zhì)塊聚集在核膜邊緣或貼近核膜，隨著藥物作用時(shí)間的延長，染色質(zhì)逐漸發(fā)生斷裂，部分核膜逐漸崩解，染色質(zhì)呈分葉狀或形成粗細(xì)不均勻的碎塊并相互分離，不均勻地分散于細(xì)胞漿中，有些細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)空泡，40 μmol/L濃度組可見大量凋亡細(xì)胞皺縮，體積縮小，密度增高(圖2)。

圖1 細(xì)胞生長抑制率的變化

圖2 光鏡下冬凌甲素不同濃度組細(xì)胞生長情況(×200)

結(jié)果可見，冬凌草甲素作用48 h后5 μmol/L冬凌草甲素發(fā)生細(xì)胞凋亡細(xì)胞較少，而10、20、30、40 μmol/L冬凌草甲素作用48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡改變，凋亡細(xì)胞可達(dá)50% ～60%，而且凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨著藥物濃度的升高而增加;凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮及細(xì)胞核碎裂。

3.3 冬凌草甲素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞Survivin、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，10、20、30、40 μmol/L 冬凌草甲素作用 48 h后，Bax mRNA的表達(dá)隨藥物濃度的增加而表達(dá)增加，Bcl-2和Survivin mRNA的表達(dá)隨藥物濃度的增加而表達(dá)降低，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(圖3)，說明冬凌草甲素能增加Bax mRNA的表達(dá)，抑制Bcl-2和Survivin mRNA的表達(dá)，且具有一定的量效關(guān)系。

圖3 不同濃度冬凌草甲素對SMMC－7721細(xì)胞Bcl-2、Survivin、Bax mRNA表達(dá)的影響

3.4 冬凌草甲素對SMMC-7721細(xì)胞Survivin、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 采用Survivin、Bax、Bcl-2抗體進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)各藥物組干預(yù)48 h后，Survivin和Bcl-2的表達(dá)呈下降趨勢，條帶變淡，Bax的表達(dá)成上升趨勢，條帶變深，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(圖4)。

圖4 不同濃度冬凌草甲素對SMMC-7721細(xì)胞Survivin、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

冬凌草甲素是從冬凌草中提取出來的一種四環(huán)二萜類化合物，其活性成分和藥理作用機(jī)制比較復(fù)雜。目前多項(xiàng)研究［3-5］證實(shí)，冬凌草甲素對多種移植性腫瘤具有明顯的抑制作用，可能機(jī)制為:(1)抗突變作用;(2)降低腫瘤細(xì)胞的鈉泵轉(zhuǎn)運(yùn)活性;(3)增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物的療效。目前還鮮有關(guān)于冬凌草甲素對人肝癌細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制的報(bào)道。

抗凋亡因子Survivin是凋亡抑制基因家族(IAP)的一個(gè)特殊成員，參與影響諸如凋亡、有絲分裂、血管生成、應(yīng)激反應(yīng)等生物過程在內(nèi)的信號通路，Survivin的表達(dá)受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期時(shí)，Survivin表達(dá)極度上調(diào);開始進(jìn)入G1期時(shí)，其表達(dá)水平又迅速下降。Survivin基因選擇性地在胚胎組織和大多數(shù)人類腫瘤中豐富表達(dá)，而在相應(yīng)的正常成人組織中，其表達(dá)水平很低或完全無表達(dá)，這種表達(dá)的特異性，使得其成為近年來腫瘤基因治療研究中的熱門靶點(diǎn)。Bcl-2是一個(gè)重要的凋亡抑制基因，其包含一種能阻止細(xì)胞凋亡的核分子，延長細(xì)胞的生命，加速DNA的修復(fù)，因此可以促進(jìn)腫瘤的生長和進(jìn)展［6］。有報(bào)道認(rèn)為中藥可以誘導(dǎo)腫瘤的凋亡，且與抑制Bcl-2的表達(dá)有關(guān)［7-8］。Bax是Bcl-2家族中研究最廣泛的促凋亡蛋白，Bax定位于細(xì)胞漿，自身可形成同源二聚體或與Bcl-2形成異源二聚體。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2較多時(shí)，Bcl-2和Bax的異源二聚體增多，凋亡趨勢減弱;當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax較多時(shí)，則Bax本身形成的同源二聚體占主導(dǎo)，則易發(fā)生凋亡，Bcl-2/Bax的比值對決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)有重要意義。Survivin和Bcl-2可通過不同的途徑控制細(xì)胞的凋亡，兩者的聯(lián)合表達(dá)是癌癥中一個(gè)重要的預(yù)后參數(shù)和治療靶點(diǎn)。

本研究采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)觀察冬凌草甲素對體外培養(yǎng)的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，濃度＞10 μmol/L的冬凌草甲素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，呈一定的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系;且先前的預(yù)試驗(yàn)也證明，當(dāng)濃度＞40 μmol/L時(shí)，冬凌草甲素對肝癌細(xì)胞的生長抑制作用進(jìn)入平臺期。這說明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是冬凌草甲素抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞體外生長的機(jī)制之一。為進(jìn)一步論證冬凌草甲素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們檢測了不同濃度的冬凌草甲素分別作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞48 h后的Survivin、Bcl-2、Bax mRNA 和蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞 Bax mRNA和蛋白隨冬凌草甲素濃度增加而表達(dá)增加，Bcl-2、Survivin mRNA和蛋白隨藥物濃度增加表達(dá)下降，表明冬凌草甲素可作為治療肝癌的有效藥物，但其是否能廣泛應(yīng)用于臨床還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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