韓學東， 張學營， 甄林林， 張 建， 任 毅

腫瘤與正常組織在基因表達模式上存在明顯差 異，可以通過檢測腫瘤患者血液中腫瘤特異性信使RNA來進行腫瘤診斷，因此血漿中某種特定的RNA分子作為腫瘤標志物用于臨床診斷顯示了良好的應(yīng)用前景［1］。miR-155是最早被發(fā)現(xiàn)的具有促癌活性的微小RNA(miRNA)，不僅在乳腺癌內(nèi)表達增高，而且可以促進體內(nèi)外乳腺癌細胞的增殖和生長。血漿和血清中也存在miR-155，其能夠?qū)购颂呛怂崦傅慕到舛３址€(wěn)定性，這表明血液循環(huán)中的miR-155有可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標志物，也有可能為乳腺癌發(fā)病機制及治療和預(yù)后判斷等研究提供一個新的方向［2］。但目前關(guān)于乳腺癌患者血液循環(huán)中miR-155的相關(guān)研究較少，本研究采用實時熒光定量PCR方法，檢測血清中miR-155的表達水平，分析其與乳腺癌臨床病理特征之間是否存在可靠的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2010年12月至2011年4月入院的67例女性患者為研究對象，其中乳腺癌患者45例，年齡29～68歲，中位年齡45歲;良性乳腺疾病患者22例，年齡27～63歲，中位年齡42歲(與乳腺癌組患者相比，具可比性)。所有乳腺癌患者均按WHO乳腺腫瘤分類標準進行病理學分型，其中浸潤性導管癌41例，浸潤性小葉癌4例;腫瘤≤2 cm(T1)18例，＞2 cm 27例(其中T2 20例，T3 7例);腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性24例，陰性21例;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ期17例;ER(+)20例，ER(－)25例;PR(+)24例，PR(－)21例。所有患者在采集血液標本前均未經(jīng)手術(shù)，未經(jīng)放、化療，且無炎癥等合并癥。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 miRcute_miRNA提取分離試劑盒、miRcute_miRNA第一鏈合成試劑盒和miRcute_miRNA熒光定量檢測試劑盒購自北京TIANGEN公司，miR-155、miR-16、U6上游引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 分離血清以及miRNA富集部分的提取 采集血液標本后在15℃ ～20℃環(huán)境下靜置30 min，血液凝固后析出血清，吸取上清液離心10 min(5 000轉(zhuǎn)/min)，去除殘存血細胞，所得淡黃色血清即可用于實驗。在采集血液標本后2 h內(nèi)吸取200 μL離心后的血清，用miRcute_miRNA提取分離試劑盒進行miRNA富集部分的提取，將提取出的miRNA保存于－70℃冰箱備用。

1.2.3 miRNA 的 cDNA 合成 應(yīng)用 miRcute_miRNA第一鏈合成試劑盒，嚴格按照說明進行操作，吸取11 μL提取后的 miRNA液體，分兩步進行cDNA合成。合成后的cDNA保存于－20℃冰箱備用。

1.2.4 miRNA的實時熒光定量檢測 采用 miR-cute_miRNA熒光定量檢測試劑盒，以miR-16和U6為內(nèi)參基因，用實時熒光定量PCR方法檢測miR-155在血清中的表達情況。miR-155、miR-16和U6的上游引物基因序列以及引物序列見表1。實時熒光定量PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，每孔加入1.5 μL 的 cDNA，1.6 μL 2.5nM 的上游引物，0.4 μL 10 nM 的 Reserve Primer，10 μL miRcute_miRNA premix(含 SYBR，含 ROX)，6.5 μL 的 dd 水，每孔重復 3次。陰性對照中不加模板cDNA而以水代替，用于檢驗是否存在 PCR污染。miR-155、miR-16和 U6的熒光定量標準曲線見圖1。

1.3 統(tǒng)計學方法

進行實時定量PCR法檢測miRNA的相對表達量時，以miR-16和U6為內(nèi)參基因?qū)δ繕嘶蜻M行歸一化處理，確保在相等數(shù)量的樣品中比較目標基因的量。血清中miRNA的表達水平計算公式如下:RQ=2－△CT，其中 RQ代表相對表達量(relative quantitation)，△CT=Ctargett－ Crefence，CTtarget、CTrefence表示某同一標本中目的基因以及內(nèi)參基因的CT值;A組與B組間miRNA的表達水平變化使用RQ=2－△△CT計算，其中△△CT=(CTtarget－ CTrefence)A組－(CTtarget－CTrefence)B組。在進行統(tǒng)計分析前，對計算所得miRNA的相對表達水平進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。不同病理特征各組間的比較采用成組t檢驗方法，使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

miR-155在乳腺癌與非乳腺癌患者血清中的表達有明顯差異，乳腺癌患者血清中miR-155表達水平比非乳腺癌患者上調(diào)18.155倍(P＜0.05)。在乳腺癌患者中，腫瘤大小為T1的血清miR-155表達水平相對于 T2和 T3患者下調(diào) 9.332倍(P＜0.05);腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者血清中miR-155表達水平比陰性者上調(diào)6.457倍(P＜0.05);Ⅰ、Ⅱ期患者血清miR-155的表達水平比Ⅲ期患者下調(diào)8.511倍(P＜0.05);與ER陰性患者相比，ER陽性患者血清中miR-155表達水平下調(diào)16.595倍(P＜0.05);與PR陰性患者相比，PR陽性患者血清中miR-155表達水平下調(diào)15.848倍(P＜0.05)。具體結(jié)果見表2、圖2～4。

表2 血清中miR-155表達水平與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

圖2 乳腺癌與非乳腺癌患者、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性與陰性者血清中miR-155表達水平的比較

圖3 乳腺癌Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ期，T1與T2、T3乳腺癌患者血清中miR-155表達水平的比較

圖4 ER、PR陽性與陰性患者血清中miR-155表達水平的比較

3 討論

微小RNA(miRNA)是一類長度為20～24個核苷酸的短序列、非編碼、單鏈小分子RNA，在胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中都有表達，而且表達水平與組織病理學特征以及疾病的不同階段之間存在著密切關(guān)系［3-4］。一般認為血液循環(huán)中的miRNA主要來源于凋亡或壞死的細胞、細胞的主動釋放以及循環(huán)細胞的裂解等。近來研究認為血液循環(huán)中的miRNA是由腫瘤細胞選擇性分泌的［5］，這就說明循環(huán)中的miRNA可以用來作為腫瘤標志物。miRNA和腫瘤的關(guān)系已成為腫瘤領(lǐng)域中新的研究熱點。

Iorio等［6］應(yīng)用微陣列芯片首次發(fā)現(xiàn)有29條miRNA在乳腺癌中表達失調(diào)，其中17條表達上調(diào)，miR-155是明顯上調(diào)的miRNA之一，提示其在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要作用。Kong等［7］研究表明miR-155在NMuMG細胞中參與了上皮細胞的間質(zhì)化和浸潤，并且表明miR-155在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在乳腺癌患者血清中的表達水平明顯上調(diào)，而且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況以及腫瘤分期等密切相關(guān)，顯示了其作為促癌基因的功能，這與既往關(guān)于miR-155的研究結(jié)論是一致的，ER、PR陽性的乳腺癌患者預(yù)后往往好于陰性患者，我們推測，乳腺癌患者血清中miR-155表達水平上調(diào)也可能與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，還需要大樣本研究和長期隨訪才能證實。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在乳腺癌患者血清中表達水平上調(diào)，且與乳腺癌的臨床病理特征密切相關(guān)，主要與腫瘤大小、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)。血清中的miRNA有可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標志物，并可用于乳腺癌的臨床診斷和預(yù)后判斷，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

［1］ Chan KC，Lo YM.Circulating tumour-derived nucleic acids in cancer patients:potential applications as tumour markers［J］.Br J Cancer，2007，96(5):681-685.

［2］ Zhao H，Shen J，Medico L，et al.A pilot study of circulating miRNAs as potential biomarkers of early stage breast cancer［J］.PLoS One，2010，5(10):e13735.

［3］ Brase JC，Johannes M，Schlomm T，et al.Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer［J］.Int J Cancer，2011，128(3):608-616.

［4］ Guo HQ，Huang GL，Guo CC，et al.Diagnostic and prognostic value of circulating miR-221 for extranodal natural killer/T-cell lymphoma［J］.Dis Markers，2010，29(5):251-258.

［5］ Pigati L，Yaddanapudi SC，Iyengar R，et al.Selective release of microRNA species from normal and malignant mammary epithelial cells［J］.PLoS One，2010，5(10):e13515.

［6］ Iorio MV，F(xiàn)erracin M，Liu CG，et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer［J］.Cancer Res，2005，65(16):7065-7070.

［7］ Kong W，Yang H，He L，et al.MicroRNA-155 is regulated by the transforming growth factor beta/Smad pathway and contributes to epithelial cell plasticity by targeting RhoA［J］.Mol Cell Biol，2008，28(22):6773-6784.