常桂英，楚海嬌，高桂鳳，尹 銳

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.釀造技術(shù)吉林省高等學(xué)校工程技術(shù)研究中心，吉林 吉林 132101）

榆耳（Gloeostereum incarnatum）屬多孔菌目伏革菌科膠韌革菌，又稱榆磨，是分布于我國(guó)長(zhǎng)白山區(qū)的一種野生真菌。其子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、多糖及多種維生素，脂肪含量低，現(xiàn)已人工栽培生產(chǎn)。其浸出液對(duì)痢疾和腸胃系統(tǒng)疾病亦有奇效，是一種不可多得的集食用及藥用于一體的珍貴食用菌品種[1]。F值是指在氨基酸混合物或寡肽中支鏈氨基酸與芳香族氨基酸含量摩爾濃度比值[2]。高F值低聚肽可以改善肝功能[3-4]，緩解血液芳香族氨基酸濃度過高導(dǎo)致肝昏迷[5]；可以提供能量，緩解疲勞、可以改善手術(shù)后病人營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[6]，廣泛應(yīng)用于燒傷、外科手術(shù)等病人及消化酶缺失患者的腸道營(yíng)養(yǎng)劑和蛋白營(yíng)養(yǎng)食品[7]；也可用作高強(qiáng)度勞動(dòng)者及運(yùn)動(dòng)員的食品營(yíng)養(yǎng)劑，能及時(shí)補(bǔ)充能量、消除疲勞、增強(qiáng)體力[8]；還具有抗氧化活性及其良好風(fēng)味等生物活性[9]。

本實(shí)驗(yàn)以榆耳為原料，測(cè)其蛋白質(zhì)組成及制備高F值低聚肽，為菌類活性肽的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榆耳子實(shí)體：由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食用菌研究所提供。

NH4Cl：北京康普惠維科技有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、1mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、苯基芥子油、三乙胺：上海生化試劑廠；甘油、聚乙烯吡咯烷酮：上海德茂化工有限公司；苯酚：荊州市麗之源化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10AT氨基酸自動(dòng)分析儀：北京溫分分析儀器技術(shù)開發(fā)有限公司；756PC紫外/可見分光光度計(jì)：上海昂拉儀器有限公司；YP2001N電子天平：北京溫分分析儀器技術(shù)開發(fā)有限公司；JL-UF超濾裝置（超濾膜孔徑10.6ku、2.0ku）：杭洲捷濾膜分離技術(shù)有限公司；SF-400高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：上海超億制藥機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氨基酸組成分析

氨基酸標(biāo)品處理：取200μL氨基酸標(biāo)品于試管中，加100mmol/L苯基芥子油100μL，加1mol/L三乙胺100μL后，放在室溫條件下衍生1h，向衍生液中加400μL正己烷洗滌，取下層溶液進(jìn)樣2μL，即得17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸色譜圖。

榆耳蛋白質(zhì)氨基酸水解液的制備及衍生處理：取60mg粉碎后的榆耳粉末，置于10mL 0.2%苯酚、6mol/L鹽酸的溶液中，在110℃水解24h后取出，用0.1%鹽酸定容，取200μL于試管中，加100mmol/L苯基芥子油100μL，加1mol/L三乙胺100μL后，放在室溫下衍生1h，向衍生液中加400μL正己烷洗滌，取下層溶液進(jìn)樣2μL[10]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮蘭法[11]。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用牛血清白蛋白配制成0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。染色液配制：稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%磷酸100mL，蒸餾水定容至1L，貯存在棕色瓶中。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取8只試管，編號(hào)，按表1加入試劑，顛倒混勻后室溫靜置5min。以管1作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)595nm處比色測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，各管加液量見表1。

表1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作加液量Table 1 Liquid adding volume for the protein standard curve

樣品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定：取2只試管（平行測(cè)定）A和B，加入樣品提取液1mL，考馬斯亮藍(lán)溶液5mL，測(cè)定方法同上，蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出的蛋白質(zhì)的量，mg；VT為提取液的總體積，mL；Vs為測(cè)定時(shí)的加樣量，mL；WF為樣品的量，mL。

1.3.3 榆耳蛋白質(zhì)的提取與純化

榆耳蛋白質(zhì)的提?。悍Q取10g樣品放在研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨；加入蛋白質(zhì)提取液（冰上預(yù)冷）300mL，冰上放置3h～4h。4℃，8000r/min離心40min，吸取上清液得到粗蛋白。

提取液配制（300mL）：1mol/LTris-HCL（pH 8.0）45mL，甘油75mL，聚乙烯吡咯烷酮6g，定容至300mL，在125℃、15min條件下高壓滅菌。

榆耳蛋白質(zhì)的純化：①去多糖：將所得的榆耳蛋白提取液減壓濃縮，并加入3倍體積的95%vol乙醇醇沉除去多糖，離心，將所得溶液減壓濃縮除去乙醇，得到除去多糖的榆耳蛋白溶液。②鹽析：向去多糖的蛋白質(zhì)提取液中按氯化銨60g/200mL（固液比）緩慢加入氯化銨粉末，鹽析后4℃靜置過夜，待沉淀完全后再離心（4000r/min、40min），棄上清，沉淀用蒸餾水溶解。③透析：取10倍以上蛋白質(zhì)體積的去離子水，將裝好樣品的透析袋懸于大燒杯中部。在燒杯底部放一個(gè)磁子，緩慢攪拌以促進(jìn)溶液交換。更換洗脫溶液數(shù)次（約30min一次），至達(dá)到透析平衡為止（洗出液中無Cl-），得榆耳蛋白質(zhì)提取液，冷凍干燥備用。

1.3.4 低聚肽的制備及F值分析

（1）低聚肽的制備：取1g蛋白質(zhì)樣品加20mL水溶解后，95℃條件下預(yù)熱15min后快速冷卻。然后加凝乳蛋白酶在50℃，pH9.0條件酶解4h，再加羧肽酶在50℃、pH 7.0條件下繼續(xù)水解4h，加酶量均為4000U/g。酶解過程中用1mol/L HCl維持pH值恒定。酶解結(jié)束后，95℃沸水浴10min以鈍化酶，快速冷卻后調(diào)pH值至4.3，4000r/min離心15min。酶解上清液用截留分子量為10.6ku和2.0ku的改性聚醚酚平板超濾膜進(jìn)行分級(jí)分離，收集10.6ku～2.0ku超濾膜的透過液，冷凍干燥，即得低聚肽粉[12-15]。

（2）F值分析：采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定低聚肽氨基酸組成及含量，根據(jù)支鏈氨基酸和芳香族氨基酸的含量進(jìn)行F值計(jì)算，F(xiàn)值計(jì)算公式：

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)品氨基酸組成分析

17種標(biāo)品氨基酸色譜圖見圖1。

圖1 17種標(biāo)品氨基酸色譜圖Fig.1 Chromatogram of seventeen standard amino acids

2.2 榆耳蛋白質(zhì)含量分析

按1.3.2方法，制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

按1.3.2方法測(cè)得榆耳蛋白質(zhì)提取液吸光度值為0.793，經(jīng)過計(jì)算，榆耳蛋白質(zhì)含量為85.1μg/mL。

2.3 榆耳蛋白質(zhì)、榆耳低聚肽氨基酸組成

通過對(duì)榆耳蛋白質(zhì)、榆耳低聚肽氨基酸色譜分析，氨基酸的組成及含量見表2。

由表2可知，榆耳低聚肽中含有豐富的支鏈氨基酸—纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，含量占34.8%。檢測(cè)出榆耳蛋白質(zhì)中17種氨基酸，其中必需氨基酸有7種，占總氨基酸含量79.0%；榆耳低聚肽中必需氨基酸有7種，占總氨基酸含量47.7%。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of protein

表2 榆耳蛋白質(zhì)、低聚肽中氨基酸組成及含量Table 2 Amino acids composition and its content inG.incarnatum protein and oligopeptide

2.4 榆耳蛋白質(zhì)、低聚肽的F值分析

通過對(duì)榆耳蛋白質(zhì)提取液、榆耳低聚肽中支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的含量分析，低聚肽的F值為22.67。榆耳蛋白質(zhì)、榆耳低聚肽中支鏈氨基酸與芳香族氨基酸含量及F值見表3。

表3 榆耳中支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的含量Table 3 Branched chain amino acid and aromatic amino acid content inG.incarnatum

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，榆耳蛋白質(zhì)經(jīng)提取、純化、酶解，可獲得高F值低聚肽，F(xiàn)值為22.67。本研究以食藥用菌榆耳為原料，為功能型低聚肽提供一個(gè)新的材料來源，為菌物蛋白質(zhì)的開發(fā)提供一個(gè)新的領(lǐng)域。

[1]李士怡.榆耳的藥用價(jià)值研究[J].吉林中醫(yī)藥，2005，19（3）：216-218.

[2]任建波.玉米高F值寡肽混合物的制備[D].長(zhǎng)春：中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué)碩士論文，2003.

[3]秦環(huán)龍.肝功能不全時(shí)氨基酸的代謝變化與支鏈氨基酸的治療作用[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，2004（4）：249-252.

[4]蔣 瀅.肝性腦病與氨基酸[J].氨基酸雜志，1990（1）：35-36.

[5]遲玉杰.高F值寡肽及其生理功能[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2005（10）：94-97.

[6]史仍飛，袁海平.支鏈氨基酸代謝與運(yùn)動(dòng)[J].上海體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2003（5）：65-67.

[7]廖國(guó)周，柴仕名.支鏈氨基酸營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展[J].飼料博覽，2005（4）：7-10.

[8]王小生.必需氨基酸對(duì)人體健康的影響[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2005（7）48-49.

[9]焦迎春，鄭曉東.活性肽在食品中的應(yīng)用研究[J].糧油與食品科技，2002（8）35-37.

[10]李 想.蛋白粉水解氨基酸含量測(cè)定與組成研究[J].中國(guó)食品工業(yè)，2009（3）：54-55.

[11]張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987.

[12]劉亞麗，李會(huì)俠，王紅新.酶解玉米渣生產(chǎn)玉米蛋白肽的研究[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2005（2）：20-21.

[13]李艷麗，陳 光，從建民.堿性蛋白酶水解法制備玉米肽的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26（2）：142-144.

[14]谷文英，過世東，沈蓓英.酶解玉米蛋白粉制備高F值寡肽[J].精細(xì)與專用化學(xué)品，2001（21）：22-23.

[15]魯曉翔，陳新華，唐澤忠.酶法改性玉米蛋白功能特性的研究[J].食品科學(xué)，2000，21（12）：13-15.