崔夫知，李 霞*，董新榮，夏東海，何麗娜

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，湖南 長沙 410128）

樟樹是我國特產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)樹種，樹干、枝葉及果實(shí)中含有多種具有應(yīng)用價(jià)值的化合物。如果實(shí)中的樟油是香料香精、醫(yī)藥和日用化工的重要原料[1]。成熟的樟樹果為紫黑色，含有大量的原花青素[2]。原花青素是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的聚多酚類混合物[3]，具有保護(hù)心血管、預(yù)防高血壓、抗腫瘤、抗輻射、抗突變以及美容等功效[4]。原花青素還可清除體內(nèi)的自由基，具有良好的抗氧化活性[5-6]。有關(guān)原花青色素的提取分離的研究較多，主要提取方法有水提取法、傳統(tǒng)溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界CO2萃取法、酶提取法[7]，分離純化方法有溶劑分級精制[8]、吸附層析法[9]。目前，人們對樟樹果紫色素的研究還較少。文赤夫等[10]報(bào)道樟樹果中原花青素具有較好的清除自由基的效果。桂克印等[11]報(bào)道酸性水提取、D406樹脂吸附、pH6的酸性乙醇洗脫純化樟樹果色素的方法。

本實(shí)驗(yàn)采用常溫條件下超聲波輔助乙醇提取新鮮樟樹果肉中的紫色素，進(jìn)一步以大孔樹脂HPD300進(jìn)行吸附，再用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇洗脫得到紫色素產(chǎn)品。全過程不添加酸性物質(zhì)，有利于保證產(chǎn)品的純天然性，而且樣品中原花青素含量高，為樟樹果中的原花青素的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹果11月下旬采摘于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，洗凈去核取果皮。HPD100、HPD100A、HPD300、HPD400、HPD600、HPD750大孔吸附樹脂：河北寶恩生物科技有限公司；原花青素（純度≥98%）對照樣品：長沙三福生物科技有限公司。

香草醛、乙醇、甲醇、鹽酸、香草醛等試劑：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；SB25-12DTN超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；AX-200型萬分之一電子天平：日本Shimadzu Philippines公司）；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；UV-160可見光分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取原花青素對照樣品3.21mg，甲醇溶解，轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，配制成原花青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，濃度c=0.1284mg/mL。

（2）顯色溶劑的配制

由A液和B液兩種顯色劑按1∶1的體積比混合配成，現(xiàn)配現(xiàn)用。A液（1%的香草醛溶液）：稱取0.5g香草醛用甲醇溶解并定容至50mL，搖勻備用；B液（8%的濃鹽酸）：量取4.0mL濃鹽酸，用甲醇定容至50mL，搖勻備用。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取1.5mL、2.5mL、3.5mL、4.5mL、5.5mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，得到系列對照樣溶液。然后，分別移取此系列溶液1mL于比色管中，同時(shí)另取1mL甲醇為空白對照，精密加入5mL顯色劑。搖勻，避光，在30℃恒溫水浴顯色30min，冷卻后在波長494nm處測定吸光度值。以吸光度值（Y）對質(zhì)量濃度（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）樣品的測定

稱取樣品適量，甲醇溶解，定容。按（2）、（3）方法測定吸光度值，然后計(jì)算物質(zhì)的量。

1.3.2 樟樹鮮果肉中原花青素的提取與上樣溶液的制備

稱取新鮮去核樟樹鮮果肉150g，用70%vol乙醇300mL浸泡15min，25℃超聲提取10min，過濾，收集濾液。濾渣再重復(fù)提取兩次，合并3次提取后的濾液，減壓回收乙醇，殘留液加入蒸餾水超聲溶解，過濾，稀釋至950mL，得到上樣液。

1.3.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附

稱取6種處理干凈的大孔吸附樹脂各1g（以濾紙吸干水分后晾干），放入100mL的具塞的錐形瓶中，加入50mL上樣液后放入25℃的水浴振蕩器中以110r/min轉(zhuǎn)速振搖，每間隔1h取上清液一次，測其吸光度值并計(jì)算其靜態(tài)吸附量。

將吸附了色素的樹脂過濾，分別用5mL蒸餾水洗去樹脂表面的殘留液。再將吸附色素的樹脂放入具塞錐形瓶中，加入20mL 95%vol乙醇在振蕩器上振搖洗脫2h，取洗脫液測定其吸光度值，計(jì)算解吸附量和解吸附率。色素在樹脂上的靜態(tài)吸附量及解吸附率按式（1）及（2）計(jì)算。

式中：C解吸液為解吸液中色素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V解吸液為解吸溶液的體積，mL；Q吸附為平衡吸附量，mg/g。

式中：Q吸附為平衡吸附量，mg/g；V上樣液為上樣液的體積，mL；C原上樣液為上樣液色素的起始質(zhì)量濃度，mg/mL；C吸附后溶液為色素吸附平衡起始質(zhì)量濃度，mg/mL；m樹脂為樹脂的質(zhì)量，g。

1.3.4 樹脂動(dòng)態(tài)吸附與洗脫

將處理好的吸附樹脂11.6g（以濾紙吸干水分后晾干，柱床體積約20mL）裝入一支50mL的酸式滴定管內(nèi)，以1BV/h的速度上樣，測定流出液的吸光度，直至吸附飽和。然后，以2BV的蒸餾水洗滌樹脂床，再分別以體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、95%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，以每15min接10mL洗脫液為一管。按式（3）計(jì)算樹脂的動(dòng)態(tài)飽和吸附量（mg/g）。

式中：Q飽和吸附量為樹脂的色素飽和吸附量，mg/g；C上樣液為上樣液色素的起始質(zhì)量濃度，mg/mL；V上樣液為上樣液的體積，mL；C流出液為流出液色素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V流出液為流出液的體積，mL；m樹脂為樹脂的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

原花青素的含量一般采用鹽酸-香草醛比色法測定[12]。首先將原花青素溶液顯色后用紫外光譜儀在波長190nm～600nm范圍內(nèi)掃描以確定最大吸收波長，得到最大吸收波長為494nm，結(jié)果與文獻(xiàn)一致[13]。然后，按實(shí)驗(yàn)方法測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，以吸光度值（Y）對濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of procyanidins

圖1結(jié)果表明，原花青素在0.1926g/L～0.7062g/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，Y=-0.02855+1.1628x，相關(guān)系數(shù)R=0.9991（n=5）。

2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附

為了考察大孔樹脂對樟樹果肉中紫色素的吸附效果，首先對6種樹脂進(jìn)行了靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)篩選。6種樹脂分別與一定濃度的樟樹果肉紫色素提取液混合振搖，每間隔1h取上清液在波長494nm處測定其吸光度值，共吸附5h，靜態(tài)吸附后上清液吸光度值變化的結(jié)果見圖2。

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)中所用的6種樹脂在吸附時(shí)間3h后上清液吸光度值下降變慢，即說明6種樹脂已將趨于吸附飽和。其中HPD300、HPD100、HPD750三種樹脂的上清液吸光度值最低，即HPD300、HPD100、HPD750樹脂對樟樹果肉中紫色素具有較好的吸附作用。計(jì)算結(jié)果表明，樹脂HPD100、HPD300、HPD750在靜態(tài)吸附5h后的飽和吸附量分別為48.46mg/g、53.85mg/g、47.56mg/g。

圖2 6種大孔樹脂對樟樹果肉紫色素的靜態(tài)吸附曲線Fig.2 Static adsorption curve of procyanidins on six different resins

吸附在樹脂上的紫色素需要容易洗脫下來，才具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。對6種吸附了紫色素的樹脂用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇進(jìn)行靜態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn)，取上清液測定洗脫溶液的吸光度值以評價(jià)其解吸附效果。結(jié)果表明，紫色素在3種樹脂HPD100、HPD300、HPD750上的的洗脫量分別為39.01mg/g、43.71mg/g、37.33mg/g，即解吸附率分別為80.50%、81.17%、78.48%。

由圖2可以看出，樹脂HPD300對樟樹果肉紫色素的靜態(tài)吸附量及解吸附率均較好，因此選用HPD300進(jìn)行樟樹果肉中原花青素的動(dòng)態(tài)吸附研究。

2.3 大孔樹脂HPD300動(dòng)態(tài)吸附曲線

以樹脂HPD300裝入一支體積為50mL的酸式滴定管中，控制上樣液流速為1BV/h，每0.5BV（10mL）接收1管，測定流出液吸光度值，繪制其動(dòng)態(tài)吸附曲線見圖3。

圖3 紫色素在HPD300樹脂上的動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.3 Dynamic adsorption curve of procyanidins on resin HPD300

由圖3可知，隨著上樣量的增大，流出液中紫色素含量逐漸增加，當(dāng)上樣體積超過1500mL，HPD300樹脂對樟樹果色素的吸附量迅速降低；當(dāng)上樣體積達(dá)到3200mL，流出液中樟樹果色素的含量與上樣液中含量基本相同，此時(shí)HPD300樹脂吸附樟樹果肉紫色素達(dá)到飽和。通過計(jì)算，HPD300樹脂對樟樹果肉紫色素的動(dòng)態(tài)飽和吸附量達(dá)到66.34mg/g。

2.4 大孔樹脂HPD300乙醇梯度動(dòng)態(tài)洗脫

上述飽和吸附紫色素的HPD300樹脂用蒸餾水洗滌除去表面的殘留上樣液后，以乙醇梯度洗脫，每個(gè)梯度的乙醇用量以洗至流出液色淡為止，洗脫液按0.5BV（10mL）接收1管，以乙醇適當(dāng)稀釋后測定其吸光度。為了直觀對比不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對紫色素的洗脫效果，將其所測定的吸光度值乘以稀釋倍數(shù)后進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇梯度洗脫曲線Fig.4 Elution curve by different concentration of ethanol

由圖4可知，吸附在樹脂上的紫色素主要由3BV左右的體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇洗脫下來。

為了進(jìn)一步比較不同濃度的乙醇對吸附在HPD300樹脂上的紫色素的洗脫效果以及紫色素的純化效果，將各濃度乙醇梯度洗脫的溶液合并回收溶劑，得到粉末狀樣品，各樣品的質(zhì)量及樣品中原花青色素的含量（以葡萄皮原花青素為對照樣品進(jìn)行測定）見表1。

表1 HPD300分離樟樹果肉紫色素的結(jié)果Table 1 Results of separation of proanthocyanidins by macroporous resin HPD300

由表1可知，吸附在樹脂上的物質(zhì)主要由體積分?jǐn)?shù)為30%、50%的乙醇洗脫下來。上樣后HPD300樹脂吸附色素的總量為771.96mg，洗脫總量為755.60mg，總洗脫率97.88%，其中體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇洗脫率為66.43%，洗脫物中原花青素的含量達(dá)到97.54%（以葡萄皮中原花青素計(jì)），為上樣液中原花青素含量（5.77%）的16.8倍。

原花青素通常以酸性水溶液或酸性醇溶液提取[14-16]，提取液調(diào)節(jié)pH值后以大孔樹脂吸附，再在酸性條件下進(jìn)行上樣吸附和洗脫進(jìn)而達(dá)到純化目的[17-18]。酸水提取雖然提取效率高，但也存在環(huán)境污染、影響產(chǎn)品的“純天然性”等問題，而且酸性溶液一般還會(huì)影響原花青素在大孔樹脂上的吸附效果。桂克印等[11]用酸性水提取樟樹果肉的原花青素，以大孔樹脂D406吸附pH=3的上樣溶液、再以pH=6的體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇洗脫達(dá)到純化色素的目的，結(jié)果色素的純化倍數(shù)為4.8倍。本實(shí)驗(yàn)在室溫下以乙醇為溶劑、超聲輔助提取樟樹果肉的原花青素，提取液經(jīng)減壓回收乙醇后加適量水稀釋后制成原上樣液；然后以大孔吸附樹脂HPD300上樣吸附，以乙醇梯度洗脫色素。結(jié)果表明，樟樹果肉的原花青素在大孔樹脂HPD300上的吸附量大，色素主要由體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇洗脫下來，純化后樣品不僅原花青素的含量高，而且為天然的紫色；樹脂床經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫后回歸為樹脂的原有白色，可直接循環(huán)使用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首先以靜態(tài)篩選方法，從6種大孔樹脂中篩選出對樟樹果肉紫色素吸附與洗脫效果較好的HPD300樹脂，然后對其進(jìn)行了樹脂動(dòng)態(tài)吸附與乙醇梯度洗脫的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，樹脂HPD300對樟樹果肉紫色素的動(dòng)態(tài)飽和吸附量為66.34mg/g樹脂，紫色素主要由體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇洗脫洗脫下來，洗脫率為66.43%，洗脫物中原花青素的含量可達(dá)到97.54%。樹脂床經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫即可再生，總洗脫率達(dá)到97.88%。該方法顯示樟樹果肉紫色素在大孔樹脂HPD300上的吸附量大、樣品中原花青素含量高、產(chǎn)品純天然等特點(diǎn)，為樟樹果中紫色素的開發(fā)利用提供了參考。

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