李從鎮(zhèn)，毛 寧*，黃銘杰，管雅靜，耿寶榮

（福建師范大學 生命科學學院，工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350108）

灰黃霉素是展青霉產(chǎn)生的一種含氯的次生代謝產(chǎn)物[1]，能抑制真菌生長的非多烯類抗生素，其作用機理是能強烈抑制真菌細胞有絲分裂前中期或后期紡錘體微管運動，從而抑制細胞周期進程[2-3]?；尹S霉素不僅普遍應(yīng)用于臨床治療皮膚和角質(zhì)層真菌感染[4-6]，而且在農(nóng)業(yè)植物保護方面也有著廣泛的應(yīng)用[7]。

目前，灰黃霉素主要通過液體發(fā)酵生產(chǎn)獲得，液體發(fā)酵周期長，耗能大，成本較高。隨著灰黃霉素在農(nóng)業(yè)上的需求量不斷增加，如何以最低成本產(chǎn)出大量灰黃霉素是科研工作者急需考慮的問題[8]。固態(tài)發(fā)酵是在固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)微生物的一種發(fā)酵方式[9]，灰黃霉素是細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，采用固態(tài)發(fā)酵后菌絲體中的產(chǎn)物易于分離提取，具有簡單易行，節(jié)約耗能，易推廣，成本低等特點[10]。本實驗室通過對灰黃霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株FS80-1進行多代紫外線-氯化鋰、半導(dǎo)體激光等方法誘變，獲得2株突變株[11-12]，其中展青霉（Penicillium patulum）LD100-1是較適合固體培養(yǎng)的。本實驗擬通過對展青霉LD100-1進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，在為進一步探究灰黃霉素的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

展青霉（Penicillium patulum）LD100-1：福建師范大學工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蔗糖30g/L，KCl 0.5g/L，NaNO33.0g/L，MgSO40.5g/L，F(xiàn)eSO40.01g/L，KH2PO41.0g/L，瓊脂20g/L，pH值自然。

種子培養(yǎng)基：大米粉50g/L，NaCl2.0g/L，CaCO38.0g/L，（NH4）2SO41.0g/L，KH2PO44.0g/L，KCl1.0g/L，NaNO31.0g/L，F(xiàn)eSO41.0g/L，pH值自然。

大米孢子培養(yǎng)基：①基礎(chǔ)培養(yǎng)液：蔗糖40g/L，NaNO32.0g/L，KCl 4g/L，MgSO40.5g/L，F(xiàn)eSO40.01g/L，KH2PO40.5g/L，pH值自然。②大米/基礎(chǔ)培養(yǎng)液=1∶0.8的比例煮沸30min，取出后裝茄子瓶，每瓶30g，121℃滅菌30min。

1.2 樣品處理和計算公式

1.2.1 種子液的制備

將活化好的展青霉斜面菌種接種到種子培養(yǎng)液中，220r/min、28℃搖床培養(yǎng)40h。

1.2.2 灰黃霉素含水量及效價的測定

將適量發(fā)酵濕料放于培養(yǎng)皿中置于105℃恒溫烘箱烘干至質(zhì)量恒定，記錄烘干前后質(zhì)量，計算含水量。含水量計算公式：

取5g固態(tài)發(fā)酵濕料浸泡于100mL無水乙醇30min，采用重氮鹽法[13]測定灰黃霉素的效價，結(jié)果以平均值±標準差表示。灰黃霉素效價計算公式：

1.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1 碳源的篩選

分別以晚秈米、玉米渣、小麥仁、燕麥仁、小米、麩皮作為固態(tài)發(fā)酵碳源基質(zhì)，按大米孢子培養(yǎng)基質(zhì)量（每瓶30g）的8%接種，攪勻，28℃培養(yǎng)14d，測定灰黃霉素效價。

1.3.2 氮源的篩選

用晚秈米作為碳源基質(zhì)，分別以玉米漿粉、黃豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3、尿素作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源（2g/L）進行固態(tài)發(fā)酵，28℃培養(yǎng)14d，測定灰黃霉素效價。

1.3.3 料液比對灰黃霉素效價的影響

以硝酸鈉為氮源，將晚秈米與基礎(chǔ)培養(yǎng)液按照不同的比例混勻，分別為1∶0.7、1∶0.75、1∶0.8、1∶0.85、1∶0.9共5個梯度，28℃培養(yǎng)14 d，測定灰黃霉素效價。

1.3.4 氯離子濃度對灰黃霉素效價的影響

按晚秈米/基礎(chǔ)培養(yǎng)液=1∶0.8的比例，探討NaCl、KCl以及NaCl+KCl三種不同的Cl-添加方式對灰黃霉素效價的影響。

1.3.5 填充物（木薯渣）對灰黃霉素效價的影響

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同含量的木薯渣（0、0.1%、0.2%、0.3%），考察不同木薯渣添加量對灰黃霉素效價的影響。

1.4 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 種齡對菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響

將種子液分別培養(yǎng)24h、30h、38h、46h、54h后按8%接種量接種于大米孢子培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)14d，測灰黃霉素效價。

1.4.2 接種量對產(chǎn)灰黃霉素的影響

分別以5%、8%、10%、12%、15%的接種量，接種于大米孢子培養(yǎng)基中，考察不同的接種量對菌株產(chǎn)灰黃霉素效價的影響。

1.4.3 發(fā)酵溫度與變溫發(fā)酵方式對產(chǎn)灰黃霉素的影響

以500mL三角瓶為發(fā)酵反應(yīng)器，物料厚度1.5cm，采用20℃、25℃、28℃、33℃、37℃ 5個不同溫度培養(yǎng)LD100-1菌株，從中選擇最適宜發(fā)酵溫度為恒溫培養(yǎng)對照，繼續(xù)進行1d～7d 28℃培養(yǎng)，7d～14d 25℃培養(yǎng)的變溫發(fā)酵。

1.4.4 發(fā)酵周期試驗

在上述最佳條件下，每天取樣測定灰黃霉素效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 LD100-1菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源基質(zhì)的篩選

以晚秈米、玉米渣、小麥仁、燕麥仁、小米、麩皮分別作為碳源基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)灰黃霉素效價，結(jié)果見圖1。由圖1可看出，以晚秈米為碳源時菌株LD100-1灰黃霉素效價明顯高于其他碳源，故選擇晚秈米作為下一步進行固態(tài)發(fā)酵試驗的碳源基質(zhì)。

圖1 不同碳源對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響(n=3)Fig.1 Effect of different carbon source on griseofulvin production

2.1.2 氮源的篩選

選取8種不同的有機氮源和無機氮源，探究LD100-1菌株最適的氮源，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，蛋白胨和NaNO3對產(chǎn)灰黃霉素的效果最好，但考慮生產(chǎn)成本，選擇NaNO3作為LD100-1發(fā)酵最適的氮源。

圖2 不同氮源對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響(n=3)Fig.2 Effect of different nitrogen source on griseofulvin production

2.1.3 培養(yǎng)基料液比對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響

將培養(yǎng)基的料液比分別調(diào)至1∶0.7、1∶0.75、1∶0.8、1∶0.85、1∶0.9，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，初始料液比為1∶0.75時，灰黃霉素效價最高，故選擇初始料液比為1∶0.75。

圖3 料液比對灰黃霉素產(chǎn)量的影響(n=3)Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on griseofulvin production

2.1.4 氯離子種類與濃度對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響

分別添加NaCl、KCl和NaCl+KCl 3種方式提供Cl-，對灰黃霉素效價影響見圖4。由圖4可知，單獨加NaCl作為培養(yǎng)基中氯離子來源的效果好于其他2種，當Cl-濃度為0.188mol/L時（即NaCl質(zhì)量濃度為11g/L），灰黃霉素效價最高，故調(diào)整單獨添加1.1%的NaCl。

圖4 不同氯離子種類與濃度對灰黃霉素效價的影響(n=3)Fig.4 Effect of the Cl-concentration on griseofulvin production

2.1.5 疏松劑木薯渣添加量對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響

添加不同量木薯渣作為疏松劑對灰黃霉素效價的影響見圖5。由圖5可以看出，木薯渣會影響到基質(zhì)的通氣量，當木薯渣添加量為0.2%時，灰黃霉素效價比沒有添加木薯渣的提高了44.4%，故可以添加0.2%木薯渣作為LD100-1固態(tài)發(fā)酵的疏松劑。

2.2 LD100-1菌株固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 種齡對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響

分別選擇培養(yǎng)24h、30h、38h、46h、54h的種子液來接種固體培養(yǎng)基，結(jié)果（圖6）可見，接種培養(yǎng)44h種齡的種子液，產(chǎn)灰黃霉素效價最高，故選擇種齡為44h。

2.2.2 接種量對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響

分別以5%、8%、10%、12%、15%接種量接種于大米孢子培養(yǎng)基，結(jié)果（圖7）可知，接種量為10%時，LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素效價相對最高，故選擇接種量為10%。

圖5 木薯渣添加量對灰黃霉素產(chǎn)量的影響(n=3)Fig.5 Effect of the amount of cassava residue on griseofulvin production

圖6 種齡對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響(n=3)Fig.6 Effect of seed age on griseofulvin production

圖7 接種量對灰黃霉素效價的影響(n=3)Fig.7 Effect of inoculum size on griseofulvin production

2.2.3 發(fā)酵溫度與變溫發(fā)酵對LD100-1菌株產(chǎn)灰黃霉素的影響

由圖8可以看出，在20℃、25℃、28℃、33℃、37℃ 5個不同溫度條件下，展青霉LD100-1菌株在28℃產(chǎn)灰黃霉素效價最高，進而以28℃恒溫發(fā)酵為對照，進行1d～7d、28℃與8d～14d、25℃變溫發(fā)酵。結(jié)果（圖9）可見，28℃恒溫發(fā)酵灰黃霉素效價為88499μg/g（干質(zhì)量），變溫發(fā)酵灰黃霉素效價為10599μg/g（干質(zhì)量），變溫發(fā)酵比恒溫發(fā)酵灰黃霉素效價提高了16.51%，說明在發(fā)酵中后期，產(chǎn)次生代謝物時降低溫度有利于灰黃霉素的生成，變溫發(fā)酵方式一定程度上優(yōu)于恒溫發(fā)酵。

圖8 發(fā)酵溫度對灰黃霉素效價的影響(n=3)Fig.8 Effect of fermentation temperature on griseofulvin production

圖9 變溫發(fā)酵對產(chǎn)灰黃霉素效價的影響比較(n=3)Fig.9 Comparison between two different temperature fermentation modes on griseofulvin production

2.2.4 固體培養(yǎng)發(fā)酵周期的選擇

由圖10可以看出，LD100-1菌株發(fā)酵周期試驗的第9d～13d，灰黃霉素效價和固態(tài)發(fā)酵料的含水量均呈遞增趨勢，14d時，效價達最大，故選擇14d作為固態(tài)發(fā)酵周期。

圖10 固體培養(yǎng)發(fā)酵周期的選擇(n=6)Fig.10 Selection of solid fermentation period on griseofulvin production

3 結(jié)果與討論

通過對LD100-1菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，獲得最佳固態(tài)培養(yǎng)基參數(shù)為氮源NaNO32g/L，氯離子NaCl 11g/L，碳源晚秈米∶基礎(chǔ)培養(yǎng)液=1∶0.75，每瓶30g并添加0.2%木薯渣；最適培養(yǎng)條件：選取培養(yǎng)44h的種子液以10%的接種量接種，培養(yǎng)14d。展青霉LD100-1菌絲體生長的最適溫度為28℃，但其產(chǎn)灰黃霉素的最適溫度與菌絲體最適生長溫度不同，應(yīng)為25℃，因此需要采用變溫的發(fā)酵方式1d～7d、28℃，8d～14d、25℃。變溫發(fā)酵可使其灰黃霉素產(chǎn)量提高16.51%，這結(jié)果也可作為液體發(fā)酵產(chǎn)灰黃霉素的參考數(shù)據(jù)。

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化后，在低物料厚度條件下，灰黃霉素效價從原來的100000μg/g提高至160000μg/g，該結(jié)果說明灰黃霉素產(chǎn)生菌的生長代謝是需要高空氣量，氧氣對其產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物有著至關(guān)重要的作用，當物料厚度從1.5cm增至2.0cm時，同等條件下，灰黃霉素效價降至119000μg/g，因此從生產(chǎn)上可考慮添加適當?shù)氖杷蓜?，以提高空氣的流通性。采用木薯渣作為疏松劑，雖能在一定程度上增加固態(tài)基質(zhì)的空隙，有助于提高灰黃霉素的產(chǎn)量，但其不是最適的疏松劑，關(guān)于疏松劑的選擇，還有待于今后進一步的篩選。

灰黃霉素效價的檢測可采用重氮鹽顯色法、高效液相色譜法及超高效液相色譜[14-15]，本試驗在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，HPLC的檢測結(jié)果比重氮鹽顯色法略低，結(jié)果更準確，但其需要貴重的儀器設(shè)備，而重氮鹽顯色法僅需普通的分光光度計，操作也相對簡單。超高效液相色譜能在短時間內(nèi)測定大量的樣品，在誘變育種和條件試驗時色譜法特別好用。根據(jù)實際條件和需要，選擇不同的檢測方法均是可以的。

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