鄧鵬飛，周 峰，李長軍，陳 雄，黃亞男，王 志*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068；2.河南省南街村（集團）有限公司，河南 臨潁 462600）

利福霉素SV是由一個萘醌發(fā)色團和脂肪鏈橋組成的[1]。萘醌發(fā)色團的主要成分是3-氨基-5-羥基苯甲酸（即AHBA），由合成芳香族氨基酸的莽草酸途徑的平行途徑合成[2]；AHBA為利福霉素芳香發(fā)色基團的直接前體[3-4]，因而，芳香氨基酸可協(xié)同抑制AHBA的生物合成[5]。脂肪鏈橋部分由8個甲基丙二酰-CoA單位和2個丙二酰-CoA單位在I型聚酮合成酶（PKS）的作用下連續(xù)縮合延伸而成[6]。焦瑞身等[7]報道：利福霉素的氨同化途徑主要包含丙氨酸脫氫酶（ADH）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOG TA），ADH在A.mediterraneiU32中的活力與利福霉素的生物合成具有負相關(guān)性，而且（GS）/（ADH）酶活性比值增大與利福霉素SV產(chǎn)量有正相關(guān)性。GS和ADH受到氨濃度的調(diào)節(jié)，高濃度氨有利于ADH催化活性增強，而低濃度氨時GS催化活性增強。這種相關(guān)性表明，GS不僅是同化氨的重要酶，而且在利福霉素生物合成過程中起著關(guān)鍵作用[8]。

基于此分析，若能提高GS的活性或者抑制ADH的積累，從而提高（GS）/（ADH）比值，可能會使代謝朝著有利于利福霉素SV合成的方向進行。工業(yè)發(fā)酵微生物在生長繁殖和產(chǎn)物合成中都需要微量金屬元素作為酶的組成部分或作為酶的活性調(diào)節(jié)劑[9]。有文獻報道，丙氨酸脫氫酶可被鋅離子所抑制[10]。因此，本研究討論了Zn2+對地中海擬無枝酸菌生物合成有機酸和利福霉素SV的影響，根據(jù)發(fā)酵過程中有機酸和氨基酸的變化，探討了Zn2+影響利福霉素SV合成的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

地中海擬無枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）U-32由河南省南街村（集團）有限公司技術(shù)中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%，黃豆餅粉1%，蛋白胨2%，CaCO30.2%，KNO30.05%。115℃、20min條件下蒸汽滅菌，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖6.0%，磷酸二氫鉀0.02%，黃豆餅粉1.5%，碳酸鈣0.5%，蛋白胨2%，KNO30.8%。120℃、20min條件下蒸汽滅菌，備用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：

一級種子：從試管斜面上挖塊0.5cm×2cm大小菌落接種于三角瓶（50mL/250mL）種子培養(yǎng)基中，在搖床上培養(yǎng)48h，培養(yǎng)條件為28℃、220r/min。

二級種子：將培養(yǎng)好的一級種子取3mL接種于三角瓶50mL/250mL）種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為28℃、220r/min，在搖床上培養(yǎng)48h后合瓶備用。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將以上培養(yǎng)好的二級種子液都以3mL接種于三角瓶（50mL/250mL）發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖床上培養(yǎng)141h后放瓶，培養(yǎng)條件為28℃、220r/min。

10L發(fā)酵罐培養(yǎng)：計料體積6L，二級種子接種量6%。培養(yǎng)條件為28℃、220r/min，空氣流量為0.5m3/h，培養(yǎng)141h后放罐。

1.2.2 效價測定方法

按照參考文獻[11]進行。

1.2.3 氨基酸的檢測

衍生化氣相色譜法，以乙酸苯乙酯為內(nèi)標，操作參考文獻進行[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)添加鋅離子對利福霉素SV效價的影響

由圖1可知，鋅離子在低濃度時，隨著濃度的增加，利福霉素SV的產(chǎn)量不斷提高，0.75mg/L時達到最大，此時的效價比對照增加了4.3%；而當鋅離子加量超過0.75mg/L時，利福霉素SV的產(chǎn)量增加甚微，可能是高濃度的鋅離子對菌體產(chǎn)生了毒性。

2.2 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對利福霉素SV合成和pH值的影響

圖1 鋅離子濃度對利福霉素SV效價的影響Fig.1 Effect of Zn2+addition on rifamycin SV in shake flasks

10L罐培養(yǎng)中基料添加0.75mg/L鋅離子對利福霉素SV合成和pH值的影響見圖2。發(fā)酵過程中的pH值趨勢與對照相似，總體上添加組pH值比對照低0.40%～1.60%，說明其氨基酸和有機酸代謝可能存在差異。另外，72h前利福霉素SV效價的增長與對照相似，96h時利福霉素SV的產(chǎn)量提高了11.72%，120h時效價提高了9.1%，但141h時僅提高了3.5%。

圖2 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對利福霉素SV合成和pH值的影響Fig.2 Effect of Zn2+addition(0.75mg/L)on rifamycin SV production and pH value in a 10L bioreactor

2.3 10L罐發(fā)酵培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對氨基酸和丙酮酸合成的影響

發(fā)酵過程中胞外丙酮酸和氨基酸的變化規(guī)律見圖3～圖5。發(fā)酵過程中（72h～141h），胞外丙酮酸濃度為49.98mg/L～85.63mg/L，比對照提高19.73%～93.72%，尤其是72h時，丙酮酸濃度為49.98mg/L，是對照組的1.94倍；胞外丙氨酸濃度在3.97mg/L～18.33mg/L之間，只有對照的40.45%～62.31%，特別是在96h胞外丙氨酸的濃度為11.90mg/L，比對照降低60%。這說明鋅離子確實抑制了丙氨酸脫氫酶的活性，致使丙氨酸（Ala）積累明顯減少，同時引起該酶催化底物——丙酮酸的積累。由于Ala會對谷氨酰胺合成酶產(chǎn)生抑制作用[9]，所以Ala降低會引起谷氨酰胺合成酶活力的提高，從而促進谷氨酰胺（Gln）的積累，而Gln會直接促進利福霉素SV的合成，使得利福霉素SV效價提高。

圖3 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對胞外丙氨酸和丙酮酸合成的影響Fig.3 Effect of Zn2+addition(0.75mg/L)on Ala and pyruvatein a 10L bioreactor

圖4 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對谷氨酸和賴氨酸合成的影響Fig.4 Effect Zn2+addition(0.75mg/L)on Glu and Lys in a 10L bioreactor

圖5 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對苯丙氨酸和酪氨酸合成的影響Fig.5 Effect of Zn2+addition(0.75mg/L)on Pheand Tyr in a 10L bioreactor

由圖4可知，96h～141h胞外谷氨酸濃度為12.59mg/L～948.12mg/L時，比對照提高7.62%～162.59%，尤其是在96h達到了927.30mg/L，是對照的2.63倍；賴氨酸濃度為20.97mg/L～26.23mg/L時，比對照提高1.99%～43.10%，尤其是在96h時，賴氨酸濃度為24.16mg/L，是對照組的1.22倍。這證實了之前的分析：鋅離子抑制了丙氨酸脫氫酶活性，Ala合成效率下降，從而使丙酮酸向Ala的轉(zhuǎn)化量減少而積累，這會引起三羧酸循環(huán)的碳流增大。由于谷氨酸（Glu）和賴氨酸（Lys）為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物-酮戊二酸和草酰乙酸衍生，因此，三羧酸上游碳通量增大促進了其合成效率。

72h～141h胞外苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）濃度趨勢見圖5。胞外酪氨酸濃度（72h～120h）與對照差異不大，但是，141h時酪氨酸濃度是1.65mg/L，是對照組的2.56倍；胞外苯丙氨酸濃度為1.64mg/L～11.13mg/L，比對照提高25.84%～92.89%。120h時Phe濃度5.48mg/L，是對照組的1.93倍。表明鋅離子除了使丙氨酸脫氫酶的活性下降引起Ala濃度減少、丙酮酸積累和促進三羧酸循環(huán)碳代謝以外，丙酮酸的積累還通過反饋抑制作用在發(fā)酵中后期促進了葡萄糖-6-磷酸流入磷酸戊糖途徑，從而使由磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸-赤蘚糖衍生的芳環(huán)氨基酸（如Phe）濃度在發(fā)酵中后期濃度高于對照組。但是3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-磷酸（DAHP）合成酶是莽草酸途徑的第一個酶，其受到芳香族氨基酸的協(xié)同反饋抑制作用[4]。而利福霉素SV的芳環(huán)發(fā)色前體（AHBA）是由于莽草酸途徑平行的代謝途徑合成的[14]，并受到芳環(huán)氨基酸的協(xié)同抑制作用[4-5]。圖5證實了Phe在發(fā)酵中后期明顯積累，這可能就是發(fā)酵后期利福霉素SV效價增加乏力的原因。

3 結(jié)論

錢世鈞等[15]曾報道丙氨酸雖不是谷氨酰胺代謝的直接產(chǎn)物，但其對GS表現(xiàn)了強烈的抑制作用。同樣的結(jié)果在許多來源的GS中都能發(fā)現(xiàn)[5]。本文研究發(fā)現(xiàn)鋅離子抑制了丙氨酸脫氫酶活性，Ala合成效率下降，引起丙酮酸向Ala的轉(zhuǎn)化量減少，使其得到了積累。同時引起三羧酸循環(huán)的碳流增大，并引起由-酮戊二酸衍生的Glu合成量增大。倪榴英等[15]曾研究GS的活力與利福霉素SV的產(chǎn)量間有正的相關(guān)性，而谷氨酰胺是Glu由谷氨酰胺合成酶（GS）催化生成，谷氨酰胺的酰胺氮又是3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）直接供體[16-17]，這樣就促進了利福霉素SV的合成。但是丙酮酸的積累同樣在發(fā)酵后期促進了磷酸戊糖途徑碳流量增大，從而使芳環(huán)氨基酸（如Tyr、Phe）濃度在發(fā)酵中后期濃度高于對照組。但是利福霉素SV的芳環(huán)前體AHBA是由于莽草酸途徑平行的代謝途徑合成的[14]，因此，AHBA的合成勢必會受到芳環(huán)氨基酸的協(xié)同抑制作用。Phe在發(fā)酵中后期明顯積累，這可能就是發(fā)酵后期利福霉素SV效價增加乏力的原因，這為下一步的研究確定了方向。

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