尹 佳

（吉林化工學院環(huán)境與生物工程學院，吉林 吉林 132022）

抗菌肽（antimicrobial peptides）是具有抗菌活性的一類肽的總稱。通常由13～50個氨基酸組成，為陽離子型多肽[1]。兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)和兩性β-折疊結(jié)構(gòu)是抗菌肽最顯著的結(jié)構(gòu)特征?？咕膶毦哂泻軓姷臍饔茫灰嗽谠讼到y(tǒng)中直接表達，一般采用融合表達或在酵母中表達[2-3]。

本研究通過對抗菌肽Magainin-Ⅱ和JaponicinⅡ兩個基因（簡稱M和J）的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的分析，用一段編碼ser-ser-gly-ser-gly-ser的柔性連接肽序列將M基因和J基因相連，以利于M和J基因各自的空間折疊。選用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）偏愛的密碼子，通過重疊區(qū)基因擴增法（SOE法）[4]人工合成MgJ基因，然后將其連接至在巴斯德畢赤酵母中高效表達的表達載體pPICZα A上。其設計目的是獲得比MagaininⅡ和JaponicinⅡ生物活性更高的抗菌肽，為雜合抗菌肽MgJ的高效分泌表達奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、質(zhì)粒pPICZα A 均由本實驗室保存，內(nèi)切酶、dNTP、T4連接酶、DNA marker、PCR 擴增試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa寶生物工程有限公司。引物由聯(lián)星生物合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 基因的合成

引物設計：根據(jù)GenBank中的基因序列，在M基因和J基因中間用鉸鏈ser-ser-gly-se r-gly-ser連接，按照畢赤酵母偏愛密碼子表[5]設計合成8個引物，其中Up1含有EcoRⅠ酶切位點，Down2含有XbaⅠ酶切位點。各引物序列見表1。

表1 合成MgJ基因的引物序列Table 1 MgJ primers sequencs

各引物與模板之間的互補關系見圖1。

圖1 各引物與模板之間的互補關系示意圖Fig.1 Complementation of primers

MgJ基因的合成：M1+M2（J1+J2）：94℃、5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，每一個循環(huán)增加0.2℃，共35個循環(huán)；72℃、10min。經(jīng)電泳檢測后割膠回收DNA片段，并命名為M基因。相同條件下J1和J2合成J基因。

Up1-M-Down1（Up2-J-Down2）：94℃預變性5min；94℃變性30s、56℃退火30 s、72℃延伸30s；每一個循環(huán)增加0.1℃，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。

全長片段：Up1-M-Down1、Up2-J-Down2互為引物，94℃預變性5min；94℃變性30s、56℃退 火30s、72℃延伸30s；每一個循環(huán)增加0.1℃，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。

以上各PCR體系均為100mL。

1.2.2 目的基因的鑒定目的基因經(jīng)PCR擴增后，取5μLPCR產(chǎn)物與DNA marker 2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 表達載體的構(gòu)建目的基因表達載體的構(gòu)建策略見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pPICZαA-MgJ構(gòu)建策略Fig.2 Construction of recombinant pPICZα A-MgJ

1.2.4 酶切和連接

目的基因全片段和pPICZα A均用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，膠回收后，16℃連接過夜。

1.2.5 感受態(tài)細胞DH5α的制備和轉(zhuǎn)化

按常規(guī)方法操作[6-8]。

1.2.6 陽性克隆的篩選

Zeocin篩選法[9]。

1.2.7 重組質(zhì)粒的鑒定及DNA序列分析

挑取重組菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒[10]，用EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切初步鑒定重組子。DNA序列分析由上海生工生物工程公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 MgJ基因的合成

各引物片斷拼接采用重疊PCR擴增出完整的基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小與預計的163bp相符。結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 目的基因的2%瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of genes

圖4 MgJ的2%瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis ofMgJ

2.2 陽性克隆的篩選結(jié)果

目的基因PCR擴增產(chǎn)物回收后與pPICZα A載體連接轉(zhuǎn)化至EcoDH5α中，由于EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切線性化的pPICZα A不可能自身環(huán)化[11-12]，因此Zeocin 抗性菌落應含有所需要的重組質(zhì)粒pPICZα A-MgJ。

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定及測序

將獲得的重組質(zhì)粒pPICZα A-MgJ用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在相應位置出現(xiàn)條帶，表明pPICZα A-MgJ構(gòu)建成功，結(jié)果見圖5。測序表明，基因序列與預期相符。

圖5 pPICZα A-MgJ雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of pPICZα A-MgJ digestion

3 結(jié)論

抗菌肽必須具備兩親結(jié)構(gòu)和正電荷，較多的正電荷與穩(wěn)定的兩性α-螺旋結(jié)合，有助于提高殺菌活性。因此，可利用這一原則來設計新型的雜合抗菌肽[13]。本研究在MagaininⅡ和JaponicinⅡ之間用一段ser-ser-gly-ser-gly-ser的柔性連接肽序列將2個基因相連，以利于增強兩段序列的連接，而且還可防止連接的過程中兩條序列單獨表達互補配對形成二聚體。為了獲得抗菌肽MgJ的全長基因片段，本研究采用了重疊區(qū)擴增基因拼接法，用互有一段互補序列的8個引物，通過PCR擴增得到了具有EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切位點的全長基因。

本研究以pPICZα A作為表達載體。因為pPICZα A即可以在原核細胞中表達，也可在真核細胞中表達，同時其表達盒的N端帶有引導分泌的α交配因子（α-MF）信號序列，表達產(chǎn)物可以分泌到細胞外的培養(yǎng)基中[14-15]。由于酵母本身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白很少，因此表達上清中的雜質(zhì)蛋白含量很低，為進一步純化表達蛋白提供了極大的方便。

研究結(jié)果表明，成功地構(gòu)建了抗菌肽MgJ基因穿梭表達載體pPICZα A-MgJ，為雜合抗菌肽MgJ的高效分泌表達奠定了基礎。

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