付 彤 廉紅霞 高騰云 趙衛(wèi)東 孫 宇 李改英

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

近年來，反芻家畜肉和奶生產(chǎn)中對環(huán)境的污染問題日益受到關(guān)注［1］。Meta分析表明，決定奶牛糞污總氮排出的主要因素是飼糧氮攝入量［2］，牛對飼糧氮的有效利用率只有23%，瘤胃代謝已被確定為反芻動物氮利用效率低的最重要原因［3］。瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的氨除被微生物用于合成菌體蛋白外，其余的氨經(jīng)消化道上皮吸收入門靜脈，隨血液進(jìn)入肝臟合成尿素。肝臟中產(chǎn)生的尿素91%可通過再循環(huán)重新進(jìn)入消化道內(nèi)［4］，這就形成了反芻動物尿素氮的再循環(huán)利用。這種氮的再循環(huán)對維持反芻動物體內(nèi)氮的平衡，尤其是在低氮飼糧條件下具有重要意義。研究表明，低氮飼糧條件下，再循環(huán)至瘤胃的尿素氮顯著增加［5］。探明氮再循環(huán)過程中尿素轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制有利于采取針對性措施提高不同飼糧和生理條件下反芻動物的氮利用［6］。

尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子(urea transporters，UTs)是高選擇性快速通透尿素的膜通道蛋白分子，在牛瘤胃中表達(dá)的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子B(UT-B)通過參與尿素在瘤胃上皮細(xì)胞(ruminal epithelium cell，REC)中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，構(gòu)成了牛瘤胃尿素氮再循環(huán)過程的重要部分，對于維持其氮平衡至關(guān)重要［7］。UT-B介導(dǎo)的經(jīng)上皮細(xì)胞的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)是經(jīng)刺激后產(chǎn)生的，且不受已知尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子A(UT-A)調(diào)控因子的影響［8］。由于尿素氮再循環(huán)對于氮的再利用起關(guān)鍵作用，所以亟待闡明瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)對于反芻動物尿素氮再循環(huán)的調(diào)控機(jī)制［9］。為此，本文旨在就UT-B基因?qū)εＡ鑫改蛩氐傺h(huán)的作用機(jī)理進(jìn)行綜述。

1 牛瘤胃尿素氮再循環(huán)

反芻動物瘤胃尿素氮循環(huán)是指，瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的氨除被微生物用于合成菌體蛋白外，其余的氨經(jīng)消化道上皮吸收入門靜脈，隨血液進(jìn)入肝臟合成尿素。尿素是反芻動物體內(nèi)氨和氨基酸代謝的主要終產(chǎn)物。在肝臟中形成的內(nèi)源尿素有3條去路:一部分尿素經(jīng)血液分泌于唾液內(nèi)，隨唾液重新進(jìn)入瘤胃;一部分通過消化道上皮擴(kuò)散進(jìn)入消化道內(nèi);多余的尿素作為廢物排出體外。牛以尿素形式從血液到消化道轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)利用大量的氮。循環(huán)氮對總氮具有重要意義。據(jù)報道，反芻動物循環(huán)氮約為飼糧可消化氮的25%［10］。肝臟中合成的尿素有一部分進(jìn)入消化道內(nèi)降解成氨。大部分氨被重新吸收進(jìn)入肝臟以合成尿素，這就形成了反芻動物瘤胃尿素氮再循環(huán)利用的機(jī)制(表1和圖1)［11-12］。

表1 不同動物種類及人體內(nèi)尿素氮再循環(huán)的動態(tài)特征Table 1 Characteristics of urea-N recycling kinetics of different animal species and human［11］ g/d

圖1 反芻動物體內(nèi)尿素氮循環(huán)代謝過程Fig.1 Cycling process of urea-N in ruminants［12］

對于大多數(shù)哺乳動物而言，肝臟中合成的尿素氮被轉(zhuǎn)移到胃腸道吸收和利用是一種普遍存在的現(xiàn)象。但對于牛而言，肝臟中合成的內(nèi)源尿素氮中，40%～80%可通過再循環(huán)重新進(jìn)入消化道內(nèi)，為瘤胃微生物提供氮源，進(jìn)而為宿主動物提供氨基酸營養(yǎng)［13］。據(jù)報道，牛肝臟內(nèi)產(chǎn)生的尿素，隨尿液排出的占33%，進(jìn)入消化道的占67%，后者又有10%隨糞便排出，而尿氮中95%都是尿素［14］。

這種氮的再循環(huán)對維持反芻動物體內(nèi)氮的平衡，尤其是在低氮飼糧條件下具有重要意義［15］。Firkins等［16］對生長牛和泌乳牛進(jìn)行了315批次檢測，結(jié)果表明，進(jìn)入門靜脈的氨態(tài)氮的凈吸收量隨著飼糧氮攝入量的增加而升高，二者存在線性回歸關(guān)系，以氨態(tài)氮形式吸收的氮量占飼糧氮攝入量的42%。研究表明，當(dāng)飼喂反芻動物低氮飼糧時，腎臟重新吸收和貯存尿素的能力增加，且進(jìn)入到消化道的尿素清除率加快，尿素氮的循環(huán)利用能力增強(qiáng)，保證了家畜適應(yīng)低氮水平的飼糧［17］。

最近的研究表明，當(dāng)給反芻動物連續(xù)間隔1～3 d飼喂不含有蛋白質(zhì)的飼糧與每天飼喂含蛋白質(zhì)飼糧相比，并沒有對家畜氮的沉積和排泄產(chǎn)生不良影響。而且當(dāng)給反芻動物飼喂氮水平不斷變化的飼糧時氮沉積也會增加［18］，主要是由于循環(huán)進(jìn)入到瘤胃中的尿素氮能夠提供合成菌體蛋白的氮源，以確保反芻動物體內(nèi)正常的氮代謝。

2 UT-B在牛瘤胃尿素氮再循環(huán)中的作用

UTs是高選擇性快速通透尿素的膜通道蛋白分子，介導(dǎo)尿素順濃度梯度的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，首先從兔腎髓質(zhì)成功克?。?9］，其由UT-A(SLC14A2)基因和UT-B(SLC14A1)基因編碼［20］。根據(jù)目前牛的基因組圖譜(NCBI，2013)［21］，牛SLC14A1基因(Gene ID:493988)位于24號染色體，該基因(GenBank:AY838799.1)大小為27 657 bp，包含10 個外顯子［22］。

近年來，UTs的研究主要集中在腎臟，其在尿液濃縮中的關(guān)鍵作用［23］已被探明。UT-B廣泛表達(dá)于腎臟、心臟、腦等組織器官，且在多個物種的胃腸道均有表達(dá)，包括:鼠［24］、人［25］、綿 羊［26］和牛［27］。

UTs對于胃腸道中尿素氮的再循環(huán)過程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［11］。Simmons等［7］以利木贊雜交牛為對象通過免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)瘤胃上皮層存在UT-B，UT-B對于進(jìn)入到胃腸道的尿素起關(guān)鍵作用。Stewart等［27］在牛的瘤胃中檢測到3.7 kb的UT-B基因，其對肝臟合成的尿素進(jìn)入瘤胃起著關(guān)鍵作用，UT-B存在2個拼接變異體:UT-B1和UT-B2，其中UT-B2是牛瘤胃中的主要形式。因此，UT-B介導(dǎo)牛瘤胃中尿素的轉(zhuǎn)運(yùn)，構(gòu)成了牛瘤胃尿素氮再循環(huán)過程的重要機(jī)制，對于維持其氮平衡至關(guān)重要［7］。體外研究表明，短時間(90 min)培養(yǎng)條件下，瘤胃上皮細(xì)胞和十二指腸黏膜細(xì)胞(duodenal mucosal cells，DMC)可合成尿素［28］。

3 瘤胃UT-B基因啟動的影響因素

UT-B介導(dǎo)的經(jīng)上皮細(xì)胞的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)是經(jīng)刺激后產(chǎn)生的，且不受已知UT-A調(diào)控因子的影響［8］。目前，關(guān)于反芻動物UT-B調(diào)控因子的研究認(rèn)為:飼糧氮水平及瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)［如揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、氨態(tài)氮等的濃度］調(diào)控反芻動物瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)，但因畜種、研究條件等不同，研究結(jié)果并不一致，由于尿素氮再循環(huán)對于氮的再利用起關(guān)鍵作用，亟待闡明瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)對于反芻動物瘤胃尿素氮再循環(huán)的調(diào)控機(jī)制［9］。

3.1 飼糧氮水平對瘤胃UT-B基因的影響

Tickle等［8］以犬腎細(xì)胞系(MDCK)為對象研究認(rèn)為，UT-B2介導(dǎo)的經(jīng)上皮細(xì)胞的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)為組成性激活，且不受已知的腎臟UT-A調(diào)控因子，如細(xì)胞內(nèi)環(huán)化腺苷酸(cAMP)、鈣(Ca)及蛋白激酶活性等的影響。

研究表明，牛瘤胃UT-B表達(dá)水平受飼糧的調(diào)控［7］。其中，飼糧氮攝入水平可改變牛瘤胃UT-B mRNA 表達(dá)豐度和 UT-B 表達(dá)水平［15，29］。且隨著飼糧中瘤胃降解蛋白(rumen degradable protein，RDP)的添加，瘤胃腹囊N-糖基化UT-B的表達(dá)水平提高，表明UT-B可能對尿素的排出起關(guān)鍵作用，而非尿素到胃腸道的再循環(huán)［26］。

3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)對瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

3.2.1 CO2

Thorlacius等［30］首次通過培養(yǎng)分離的瘤胃組織證實(shí)了CO2對經(jīng)瘤胃的尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)有刺激效應(yīng)。Abdoun等［31］利用尤斯灌流(Ussing chamber)方法離體培養(yǎng)瘤胃上皮組織表明，隨著CO2供給量增加，經(jīng)瘤胃上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的尿素氮量亦增加;與pH為7.4時相比，當(dāng)pH為6.4時尿素氮的轉(zhuǎn)運(yùn)量增加最多。就目前關(guān)于CO2對瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)的影響而言，均是采用體外技術(shù)進(jìn)行研究，雖然有證據(jù)表明CO2對瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)存在影響，但其是否受UT-B基因調(diào)控，尚有待于進(jìn)一步在活體試驗中加以探明［30-31］。

3.2.2 VFA濃度和pH

Abdoun等［31］離體研究表明，當(dāng)黏膜 pH從7.4降至5.4時，從漿膜至黏膜的尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)量呈鐘形曲線，當(dāng)pH為6.0～6.4時，尿素氮的轉(zhuǎn)運(yùn)率最高;體試驗表明，pH為6.0～6.4時，改變瘤胃因子(如VFA濃度)對再循環(huán)至瘤胃的尿素氮有顯著影響。

瘤胃VFA，特別是丁酸濃度，對經(jīng)瘤胃的尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)有刺激效應(yīng)。Simmons等［7］研究表明，與飼喂青貯型飼糧相比，飼喂精料型飼糧的利木贊雜交牛瘤胃UT-B2 mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)水平均較高，且瘤胃丁酸水平亦較高(11.7%的總VFA中9.3%為丁酸)。可見，丁酸可能影響了UT-B2的表達(dá)，進(jìn)而提高了進(jìn)入瘤胃的尿素氮。

而 Oba等［32］對綿羊瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行了90 min的體外培養(yǎng)，結(jié)果表明，VFA濃度及丙酸乙酸比未對瘤胃上皮細(xì)胞尿素合成產(chǎn)生影響;精氨酸增加了瘤胃上皮細(xì)胞尿素的合成。

目前，關(guān)于反芻動物瘤胃尿素氮再循環(huán)的調(diào)控因子的研究認(rèn)為:飼糧氮水平及瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)(如VFA、氨態(tài)氮濃度等)調(diào)控反芻動物瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)，但研究結(jié)果并不一致，由于尿素氮再循環(huán)對于氮的再利用起關(guān)鍵作用，所以亟待闡明瘤胃因子對于反芻動物瘤胃尿素氮再循環(huán)的調(diào)控機(jī)制［9］。

4 小結(jié)

UT-B在牛瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用，對于提高牛對飼糧氮的有效利用率具有重要意義，其基因表達(dá)受飼糧氮水平和瘤胃發(fā)酵參數(shù)及內(nèi)環(huán)境指標(biāo)等因素影響。UT-B對于牛瘤胃尿素氮再循環(huán)的具體調(diào)控機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

［1］FAO.Livestock’s long shadow:environmental issues and options［EB/OL］.［2013-06-15］.http://www.fao.org/docrep/010/a0701e/a0701e00.HTM.

［2］YAN T，F(xiàn)ROST J P，AGNEW R E，et al.Relationships among manure nitrogen output and dietary and animal factors in lactating dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2006，89(10):3981-3991.

［3］KOHN R A，DINNEEN M M，RUSSEK-COHEN E，et al.Using blood urea nitrogen to predict nitrogen excretion and efficiency of nitrogen utilization in cattle，sheep，goats，horses，pigs，and rats［J］.Journal of Animal Science，2005，83(4):879-889.

［4］MARINI J C，SANDS J M，VAN AMBURGH M E.Urea transporters and urea recycling in ruminants［M］//SEJRSEN K，HVELPLUND T，NIELSEN M O.Ruminant physiology.Wageningen，Netherlands:Wageningen Academic Publishers，2006:155-171.

［5］DORANALLI K，PENNER G B，MUTSVANGWA T.Feeding oscillating dietary crude protein concentrations increases nitrogen utilization in growing lambs and this response is partly attributable to increased urea transfer to the rumen［J］.The Journal of Nutrition，2011，141(4):560-567.

［6］SUNNY N E，OWENS S L，BALDWIN R L，et al.Salvage of blood urea nitrogen in sheep is highly dependent on plasma urea concentration and the efficiency of capture within the digestive tract［J］.Journal of Animal Science，2007，85(4):1006-1013.

［7］SIMMONS N L，CHAUDHRY A S，GRAHAM C，et al. Dietary regulation of ruminal bovine UT-B urea transporter expression and localization［J］.Journal of Animal Science，2009，87(10):3288-3299.

［8］TICKLE P，THISTLETHWAITE A，SMITH C P，et al.Novel bUT-B2 urea transporter isoform is constitutively activated［J］.American Journal of Physiology:Regulatory，Integrative and Comparative Physiology，2009，297(2):R323-R329.

［9］KIRAN D.Factors regulating urea-nitrogen recycling in ruminants［D］.Ph.D.Thesis.Saskatoon SK:University of Saskatchewan，2010:131.

［10］OBARA Y，DELLOW D W，NOLAN J V.Effects of energy-rich supplements on nitrogen kinetics in ruminants［M］//TSUDA T，SASAKI Y，KAWASHIMA

R.Physiological aspects of digestion and metabolism in ruminants.San Diego:Academic Press，1991:515-539.

［11］STEWART G S，SMITH C P.Urea nitrogen salvage mechanisms and their relevance to ruminants，non-ruminants and man［J］.Nutrition Research Reviews，2005，18(1):49-62.

［12］張瑩，郭旭生，丁路明，等.反芻動物尿素氮再循環(huán)利用的研究進(jìn)展［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2009，21(5):609-616.

［13］LAPIERRE H，LOBLEY G E.Nitrogen recycling in the ruminant:a review［J］.Journal of Dairy Science，2001，84(Suppl.):E223-E236

［14］徐紅蕊，時建青，趙國琦.反芻動物體內(nèi)尿素氮代謝研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2006，25(1):23-24，27.

［15］REYNOLDSC K，KRISTENSEN N B.Nitrogen recycling through the gut and the nitrogen economy of ruminants:an asynchronous symbiosis［J］.Journal of Animal Science，2008，86(Suppl.):E293-E305.

［16］FIRKINS J L，REYNOLDS C K.Whole animal nitrogen balance in cattle［C］//PFEFFER E，HRISTOV A N.Nitrogen and phosphorus nutrition of cattle.Wallingford，UK:CAB Int.，2005:167-186.

［17］ISOZAKI T，GILLIN A G，SWANSON C E，et al.Protein restriction sequentially induces new urea transport processes in rat initial IMCD［J］.The American Journal of Physiology，1994，266(5pt2):F756-F761.

［18］ARCHIBEQUE SL，F(xiàn)REETLY H C，F(xiàn)ERRELL C L，et al.Net portal and hepatic flux of nutrients in growing wethers fed high-concentrate diets with oscillating protein concentrations［J］.Journal of Animal Science，2007，85(4):997-1005.

［19］YANG B X，BANKIR L，GILLESPIE A，et al.Ureaselective concentrating defect in transgenic mice lacking urea transporter UT-B［J］.The Journal of Biological Chemistry，2002，277(12):10633-10637.

［20］SMITH C P，ROUSSELET G.Facilitative urea transporters［J］.The Journal of Membrane Biology，2001，183(1):1-14.

［21］ZIMIN A V，DELCHER A L，F(xiàn)LOREA L，et al.A whole-genome assembly of the domestic cow，Bos taurus［J］.Genome Biology，2009，10(4):R42.

［22］NCBI.Bos taurus urea transporter(SLC14A1)gene，complete cds，alternatively spliced［EB/OL］.Gen-Bank:AY838799.1，2005［2013-06-15］.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY838799.1.

［23］UCHIDA S，SOHARA E，RAI T，et al.Impaired urea accumulation in the inner medulla of mice lacking the urea transporter UT-A2［J］.Journal of Molecular and Cellular Biology，2005，25(16):7357-7363.

［24］INOUE H，KOZLOWSKI S D，KLEIN J D，et al.Regulated expression of renal and intestinal UT-B urea transporter in response to varying urea load［J］.American Journal of Physiology.Renal Physiology，2005，289(2):F451-F458.

［25］INOUE H，JACKSON SD，VIKULINA T，et al.Identification and characterization of a kidd antigen/UT-B urea transporter expressed in human colon［J］.American Journal of Physiology:Renal Physiology，2004，287(1):C30-C35.

［26］LUDDEN P A，STOHRER R M，AUSTIN K J，et al.

Effect of protein supplementation on expression and distribution of urea transporter-B in lambs fed lowquality forage［J］.Journal of Animal Science，2009，87(4):1354-1365.

［27］STEWART G S，GRAHAM C，CATTELL S，et al.UT-B is expressed in bovine rumen:Potential role in ruminal urea transport［J］.American Journal of Physiology:Regulatory，Integrative and Comparative Physiology，2005，289(2):R605-R612.

［28］OBA M，BALDWIN Ⅵ R L，OWENSSL，et al.Metabolic fates of ammonia-N in ruminal epithelial and duodenal mucosal cells isolated from growing sheep［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(11):3963-3970.

［29］R?JEN B A，POULSEN SB，THEIL PK，et al.Short communication:effects of dietary nitrogen concentration on messenger RNA expression and protein abundance of urea transporter-B and aquaporins in ruminal papillae from lactating Holstein cows［J］.Journal of Dairy Science，2011，94(5):2587-2591.

［30］THORLACIUS S O，DOBSON A，SELLERS A F.Effect of carbon dioxide on urea diffusion through bovine ruminal epithelium［J］.The American Journal of Physiology，1971，220(1):162-170.

［31］ABDOUN K，STUMPFF F，RABBANI I，et al.Modulation of urea transport across sheep rumen epithelium in vitro by SCFA and CO2［J］.American Journal of Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2010，298(2):G190-G202.

［32］OBA M，BALDWIN Ⅵ R L，OWENSSL，et al.Urea synthesis by ruminal epithelial and duodenal mucosal cells from growing sheep［J］.Journal of Dairy Science，2004，87(6):1803-1805.