劉明美 齊 斌 趙國琦 張文豪 朱偉成

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009;2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術學院淮安生物工程分院，淮安 223200;3.常熟理工學院，蘇州 215500)

被譽為“綠色牛奶”、“植物肉”的大豆蛋白是一種可與動物蛋白相媲美的優(yōu)質蛋白質，目前國內外主要以蛋白質變性程度較低的低溫脫脂豆粕為原料，通過堿溶酸沉法提?。?-3］。而占國內豆粕產量90%以上的高溫脫脂豆粕經高溫處理后，一方面，因豆粕內大部分的不耐熱抗營養(yǎng)因子活性被降低或滅活，從而更有利于動物對蛋白質的消化吸收和利用;另一方面，豆粕蛋白變性嚴重，不利于蛋白提取，主要用作畜禽飼料，從而大大限制了高溫脫脂大豆粕深加工產品的開發(fā)及應用。近年來，國內外雖然開展了利用高溫脫脂豆粕生產醇洗濃縮蛋白［4］、酶解［5］或超聲提取蛋白［6-7］等研究，但缺少對影響其蛋白提取率各因素的系統(tǒng)研究，從而無法較為全面地確定高溫脫脂豆粕蛋白提取的最佳條件。為此，我們在前人研究基礎上，通過單因素和正交試驗設計，采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉與超聲輔助技術相結合的方法，對影響蛋白提取率的提取溫度、超聲時間、pH、粉碎細度、水料比、超聲功率、提取時間7因素進行了系統(tǒng)研究，并優(yōu)化了高溫脫脂豆粕的大豆蛋白提取條件，以期為高溫脫脂豆粕進行深加工，開發(fā)其更大、更廣的利用價值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高溫脫脂豆粕(粗蛋白質含量為51.96%):吉林豐正大豆食品有限公司;三蒸水:實驗室自制;考馬斯亮藍試劑盒:南京建成生物工程研究所;HCl與NaOH:分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器;FS-6D型大流水式粉碎機;賽多利斯PB-21型酸度計;SHA-C型恒溫水浴鍋;FA2004型分析天平;Anke低速大容量離心機;756型分光光度計;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱;SZ-97型自動三重純水蒸餾器。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素試驗設計

在單因素試驗中，分別研究了提取溫度、超聲時間、pH、粉碎細度、水料比、超聲功率、提取時間對高溫脫脂豆粕蛋白提取率的影響。各因素設置水平如下:提取溫度，20、30、40、50、60、70 ℃;超聲時間，0、5、10、15、20、30 min;pH，8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5;粉碎細度，0(未粉碎)、40、60、80、100、120 目;水料比，5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g);超聲功率，0、200、300、400、500 W;提取時間，15、30、45、60、90 min。各因素的每個水平設3個重復。測定某一因素時其他因素為非測定因素，預試驗選擇非測定因素的水平為提取溫度50℃、超聲時間15 min、pH 10.0、粉碎細度80目、水料比15∶1(mL/g)、超聲功率 400 W、提取時間60 min(超聲+水浴震蕩)。

1.3.2 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，設計出7因素3水平正交試驗(表1)，設3個重復。

表1 L18(3)7正交試驗設計Table 1 L18(3)7 orthogonal design

1.4 大豆蛋白的提取與測定方法

準確稱取經去雜、粉碎等預處理的高溫脫脂豆粕1 g，按比例加入三蒸水，調節(jié)其pH，在一定溫度下經不同功率不同超聲時間處理后，恒溫水浴振蕩提取一定時間，通過滴加1 mol/L NaOH或HCl溶液保持液料pH在提取過程中不變。浸提后離心(4 000 r/min，20 min)，收集上清液，考馬斯亮藍法測定上清液的蛋白質含量。

凱氏定氮法測定試驗材料高溫脫脂豆粕中的粗蛋白質含量［8］。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2007整理后，采用SPSS 16.0單因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)，以P＜0.05作為差異顯著性標準。

2 結果

2.1 單因素提取條件對蛋白提取率的影響

在其他6個因素相對固定的條件下，分別測定了不同水平的某一因素對大豆蛋白提取率的影響，結果如表2所示。由表2可以看出，各粉碎組的豆粕蛋白提取率顯著高于未粉碎組(P＜0.05)，其中80目組的蛋白提取率顯著高于其他各組(P＜0.05)，較0、40、60目組的蛋白提取率分別提高了83.81%、40.46%和17.43%;粉碎細度高于80目后，蛋白提取率卻出現(xiàn)下降趨勢。在本試驗設置的pH范圍內，隨著pH的增加，大豆蛋白提取率升高，其中pH 10.5組的蛋白提取率比pH 8.0組提高了38%，差異顯著(P＜0.05)。提取溫度小于50℃時，蛋白提取率隨著提取溫度升高而顯著增加(P＜0.05);但當提取溫度高于50℃后，蛋白提取率增加減緩，隨著提取時間組的延長，蛋白提取率逐漸上升，但差異不顯著(P＞0.05)。水料比為 20∶1組的蛋白提取率比 5∶1組提高了21.39%，顯著高于水料比為 5∶1、10∶1、15∶1 組的蛋白提取率(P＜0.05)。超聲組的大豆蛋白提取率都顯著高于未超聲組(P＜0.05)，但不同超聲時間組的差異卻不顯著(P＞0.05)，超聲時間5 min組的大豆蛋白提取率比未超聲組提高了29.76%。超聲功率在0～300 W范圍內時，隨著超聲功率的提高，蛋白提取率增加，超聲功率300 W組的提取率比未超聲組提高了8.24%，超聲功率400、500 W組的蛋白提取率稍微下降，但差異不顯著(P＞0.05)。

表2 單因素提取條件對蛋白提取率的影響Table 2 Effects of single factor extraction condition on protein extraction rate %

2.2 正交試驗

通過SPSS 16.0軟件對正交試驗結果進行方差分析，輸出的數(shù)據(jù)較多，從中節(jié)選部分列出。由表3可以看出，在本試驗選擇的7個因素中，超聲功率和提取時間對高溫脫脂豆粕蛋白提取率的影響顯著，其他因素影響不顯著(P＞0.05);各因素影響依次是:提取時間＞超聲功率＞水料比＞超聲時間＞粉碎細度＞提取溫度＞pH。

以大寫字母分別代表下列各因素:提取溫度(A)、超聲時間(B)、pH(C)、粉碎細度(D)、水料比(E)、超聲功率(F)、提取時間(G)，綜合表4和表5可以看出:A3平均值(45.144)最大，A3＞A2＞ A1，但 A1、A2、A3之 間差異不顯 著(P ＞0.05);同理，可以通過另外幾張表格的分析得出:B2平均值(45.631)最大，B2＞ B3＞ B1，但 B1、B2、B3之間差異不顯著(P＞0.05);C2平均值(44.706)最大，C2＞ C3＞ C1，但 C1、C2、C3之間差異不顯著(P＞0.05);D3平均值(45.690)最大，D3＞D2＞ D1，但 D1、D2、D3之間差異不顯著(P ＞0.05);E3平均值(46.201)最大，E3＞E2＞E1，但E1、E2、E3之間差異不顯著(P ＞0.05);F3平均值(48.173)最大，F(xiàn)3＞F1＞F2，且 F1與 F2之間差異不顯著(P＞0.05)，F(xiàn)3與 F2、F1之間差異顯著(P＜0.05);G2平均值(47.415)最大，G2＞G3＞G1，且 G1與 G2、G3之間差異顯著(P ＜0.05)，但G2與G3之間差異不顯著(P＞0.05)。

表3 正交試驗方差分析表(因變量∶提取率)Table 3 The analysis of variance table of orthogonal experiment(dependent variable∶extractive rate)

表4 單因素統(tǒng)計量表(提取溫度∶提取率)Table 4 The statistics table of single factor(extractive temperature∶extractive rate)

表5 配對比較表(因變量∶提取率)Table 5 Pair-wise comparisons table(dependent variable∶extractive rate)

3 討論

3.1 單因素提取條件對蛋白提取率的影響

3.1.1 粉碎細度對大豆蛋白提取率的影響

李寶山等［9］試驗表明，60和80目高溫脫脂豆粕的蛋白提取率分別是39.82%和44.95%。一般來說，豆粕粉碎越細，其細胞壁被破壞越嚴重，且相同質量豆粕的表面積越大，從而與提取溶劑接觸的面積也就越大，越有利于蛋白的提取;但粉碎過細會增加過濾和漿渣分離的難度，反而影響蛋白得率。本試驗結果表明，粉碎細度為80目組的高溫脫脂豆粕的蛋白提取率最高，分別比0、40、60目組提高了83.81%、40.46%和17.43%;但超過80目后的提取率卻有所降低。

3.1.2 水料比對大豆蛋白提取率的影響

水料比是影響大豆蛋白提取率的另一重要因素。鄭田要等［10］通過試驗發(fā)現(xiàn)，料水比為1∶30(g/mL)、pH為10.0、熱水處理時間20 min時的高溫豆粕蛋白溶出率可達59.03%。一般來說，加水量過少，堿提液濃度高，體系黏度大，蛋白不易溶出;但隨著加水量的增加，蛋白溶出率卻會趨于平衡。本試驗結果也證實了這一點。

3.1.3 pH對大豆蛋白提取率的影響

堿液可使豆粕緊密結構變得疏松，促進結合物與蛋白分離，提高蛋白提取率，因此，理論上講，在一定堿性范圍內，pH越高，蛋白溶出率越高;但堿性過強會引起蛋白質極端變性，產生有毒物質，且部分蛋白質會發(fā)生水解，生成低分子量、低密度產品，以乳清形式流失，反而使蛋白得率下降。因此，綜合考慮豆粕大豆蛋白質的提取率和提取蛋白的質量，本試驗將pH設定在8.0～10.5之間，并證實了pH為10.5時，蛋白提取率最高，高達56.97%，是pH為8.0時的1.38倍。這與鄭田要等［10］的試驗結果相似。

3.1.4 提取溫度和時間對大豆蛋白提取率的影響

車康等［11］通過試驗發(fā)現(xiàn)，在55～75℃提取溫度內，65℃時的高溫豆粕蛋白提取率最高。本試驗結果也表明，提取溫度50℃時的蛋白提取率在20～70℃內最高。究其原因可能是:當提取溫度較低時，增加提取溫度可以促進分子運動，從而有助于蛋白的浸出;但當溶出率達到最大值后，繼續(xù)提高提取溫度一方面可能增加了水分蒸發(fā)，致使水料比下降，另一方面可能是提取溫度過高時蛋白質熱變性程度增加，引起蛋白質聚集，從而使蛋白質的溶解度下降，最終從而導致大豆蛋白提取率下降。

大豆蛋白要從高溫豆粕中溶出，需要與溶劑進行充分的接觸，因此，在一定時間范圍內，浸提時間越長，越利于豆粕蛋白的浸出，但超過一定時間后，隨著時間的延長蛋白溶出率趨于平衡，提取率就不再增加。本試驗結果表明，堿提時間為45 min時的蛋白提取率最高。這與車康等［11］的試驗結果一致。

3.1.5 超聲時間和功率對大豆蛋白提取率的影響

超聲波因具有成本低、設備簡單、操作容易、提取率高等優(yōu)點而被廣泛應用于目的物質的強化提取。李寶山等［6］將高溫粕分別進行了先粉碎后超聲、先超聲后粉碎和直接粉碎處理后提取大豆蛋白，結果表明，其大豆蛋白提取率分別為55.21%、53.46%和36.21%。楊曉泉等［7］研究發(fā)現(xiàn)用300 W、12 Hz低頻超聲處理8 min，高溫脫脂豆粕的蛋白浸出率為73.43%，而45℃加熱攪拌提取1 h，高溫脫脂豆粕的蛋白浸出率僅為49.58%。本試驗發(fā)現(xiàn)，0～500 W內的超聲功率，300 W超聲處理的大豆蛋白提取率最高;超聲時間為0～30 min時，20 min超聲處理的大豆蛋白提取率最高。這可能與其能促使溶劑更大程度的滲入細胞中，從而提高物質傳遞及破裂細胞壁便于目的物質釋放等有關［12］。

3.2 篩選最佳提取條件

蛋白質在用堿處理或加熱時會生成賴丙氨酸［13］，而試驗表明賴丙氨酸可使大鼠腎臟產生病變(肥大)，腎小管細胞質、細胞核增大［14］，且細胞癌變前期也是細胞質及細胞核的肥大［15］。因此，為避免高溫、高pH致使大豆蛋白提取過程中有毒物質賴丙氨酸的生成，同時考慮較高提取率的獲得，在前面單因素試驗基礎上，我們將正交試驗中的提取溫度設為40、45、50℃ 3個水平，pH設為9.0、9.5、10.0 3個水平。這可能是本試驗蛋白提取率低于車康等［11］超聲波法及鄭田要等［10］熱壓法提取率的原因之一;而高溫豆粕加工工藝不同，受熱變性程度不同，提取率也就必然會存在差異，這可能是本試驗中提取率較低的原因之二。

正交試驗的直觀分析法存在一定的局限性，不能估計試驗過程及試驗結果測定中必然存在的誤差，因而不能區(qū)分某因素各水平所對應的試驗結果的差異究竟是由于水平的改變所引起的，還是由試驗誤差所引起的。因此，我們通過SPSS 16.0軟件對正交試驗結果進行了方差分析，并得出結果:超聲功率和提取時間對高溫脫脂豆粕蛋白提取率的影響極為顯著，其他因素影響不顯著。各因素影響大小順序依次是:提取時間＞超聲功率＞水料比＞超聲時間＞粉碎細度＞提取溫度＞pH。

4 結論

①在一定范圍內，高溫脫脂豆粕的蛋白提取率隨著各因素設置水平的提高而提高。

②各因素對大豆蛋白提取率影響依次是:提取時間＞超聲功率＞水料比＞超聲時間＞粉碎細度＞提取溫度＞pH。

③從節(jié)約、提高蛋白提取率及盡可能減少或避免有毒物質生成等角度出發(fā)，高溫脫脂豆粕蛋白提取的最優(yōu)條件組合為:提取時間45 min，超聲功率 500 W，水料比 25∶1(mL/g)，超聲時間15 min，粉碎細度60目，提取溫度45℃，pH 9.0。

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