楊寧，郝林，楊鵬

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801）

納米銀是將粒徑做到納米級(jí)的金屬銀單質(zhì)。納米銀的合成包括物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法［1～3］。利用物理方法制備的納米銀純度高、活性高，但是產(chǎn)物粒度分布比較寬，容易發(fā)生團(tuán)聚。利用化學(xué)方法制備的納米銀具有較好的分散性，粒徑分布窄，形貌比較均勻，但是材料表面往往有雜質(zhì)?；瘜W(xué)還原法通常涉及外部還原劑和有機(jī)溶劑。已報(bào)道的納米銀的合成方法中，使用較多的還原劑有肼、硼氫化鈉、二甲基甲酰胺等，使用的溶劑大部分為有機(jī)溶劑，這些化合物毒性強(qiáng)，污染嚴(yán)重，對(duì)環(huán)境和生物會(huì)產(chǎn)生潛在的危害。而生物制備納米銀的方法所選原料為純天然，制備方法簡(jiǎn)單，無(wú)污染。生物合成法采用的原料有微生物、酶和一些植物等。與微生物和酶相比，利用植物合成納米銀的方法省去了培養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)節(jié)，制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，更適合于大規(guī)模的納米金屬粒子的合成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可合成納米銀的植物有樟腦樹(shù)葉［4］、天竺葵［5］、銀杏樹(shù)葉和木蘭［6］等。

芒果是漆樹(shù)科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera L.）的一種熱帶常青樹(shù)產(chǎn)果實(shí)，其外形和果皮顏色多樣，肉質(zhì)細(xì)嫩、香甜、有特殊風(fēng)味，集熱帶水果精華于一身，被譽(yù)為“熱帶水果之王”，是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物，是世界第二大熱帶水果。芒果除鮮食外，主要被加工成芒果飲料、芒果干、芒果罐頭、果凍等。據(jù)估計(jì)，芒果皮占鮮果重的7%～24%，芒果皮作為芒果工業(yè)化加工生產(chǎn)中產(chǎn)生的加工副產(chǎn)物，一般被拋棄，既造成資源的巨大浪費(fèi)，又污染環(huán)境。據(jù)研究，芒果皮中含有大量黃酮化合物、多酚化合物和多糖，都是很好的還原劑。實(shí)驗(yàn)研究了以食品工業(yè)下腳料芒果皮作為還原劑和分散劑，合成分散性很好的納米銀，探討了制備過(guò)程中影響納米粒徑的因素，并用透射電鏡觀察納米粒子的形貌。這些合成的納米粒子可以用于水體、土壤污染的治理，食品行業(yè)抑菌材料等等。這對(duì)提高芒果的附加值和利用率，避免資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

芒果皮（市售），硝酸銀（分析純，購(gòu)自天津試劑一廠）

1.1.2 菌種

菌種：大腸桿菌 （Escherichia coli），葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus substilus）均為微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高速電動(dòng)離心機(jī)，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津 UV－visible2400系列

透射電鏡，Jeol JEM100SX

X射線衍射儀（XRD），德國(guó)布魯克（D8ADVANCE）

1.2 方法

1.2.1 芒果皮提取物的制備

新鮮芒果皮用雙蒸水清洗后，稱取100g，添加250mL雙蒸水，榨成汁。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 pH值對(duì)納米銀合成的影響

將3mL芒果皮提取物與27mL 1mM的硝酸銀溶液混合。80℃水浴15min。分別調(diào)節(jié)硝酸銀溶液的pH 值為2.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0。

1.2.3 芒果皮提取物不同添加量對(duì)納米銀合成的影響

分別取芒果皮提取物0.1mL，0.4mL，0.7 mL，1mL和3mL，加1mM的硝酸銀溶液定容至30mL。pH值選取上一步得出的納米銀粒徑最小時(shí)的pH值。

1.2.4 不同硝酸銀濃度對(duì)納米銀合成的影響

配置濃度為0.5，1.0，2.0和4.0mM 的硝酸銀溶液。分別取其與芒果皮提取物混合。芒果皮的添加量和pH值選取上步得出的納米銀粒徑最小時(shí)的芒果皮添加量和pH值。

1.2.5 檢測(cè)

將1.2.2、1.2.3、1.2.4的試樣，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)是否有合成納米銀。用透射電鏡（TEM）觀察合成納米銀的粒徑。用X射線衍射儀（XRD）對(duì)合成的納米銀進(jìn)行表征。

1.2.6 抑菌試驗(yàn)

選取3種代表性菌種：大腸桿菌 （Escherichia coli）（革蘭氏陰性菌），葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（革蘭氏陽(yáng)性菌）和枯草芽孢桿菌（Bacillus substilus）（芽孢菌），采用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基將供試菌種分別接種到裝有培養(yǎng)基的試管內(nèi)，在37℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。取活化好的菌種斜面，用生理鹽水配制成每毫升含106～107CFU的菌懸液，備用。將已滅菌的肉湯培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約20mL，凝固。用生理鹽水洗下試管內(nèi)的菌苔并稀釋。吸取1mL菌液倒入平板表面，用涂布器將菌液涂布均勻。放置牛津杯，加入合成的納米銀溶液。放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。用芒果皮提取液作對(duì)照。操作同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)納米銀合成的影響

在利用芒果皮提取物合成納米銀的過(guò)程中，pH值是一個(gè)重要的影響因素。文獻(xiàn)表明［7，8］，納米銀在400～440nm之間有吸收峰。通過(guò)紫外－可見(jiàn)分光光度法對(duì)反應(yīng)后的溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到溶液pH 2.0時(shí)沒(méi)有吸收峰，當(dāng)溶液pH 為3.0，5.0，7.0，9.0和11.0時(shí)，吸收峰的位置分別在434.0，426.5，422.5，418.5和412.0nm 處。如圖1可見(jiàn)，隨著pH值的升高，吸收峰變得尖而窄。這是由于合成納米銀的粒徑和數(shù)量發(fā)生了變化。

采用透射電鏡（TEM）表征溶液pH值分別為3.0和11.0下合成的納米銀。如圖2所示，所有合成的納米銀粒子為近似球形。在高pH值下，納米銀粒子的形態(tài)更規(guī)則，更分散不容易團(tuán)聚。合成的納米銀粒子在pH 3.0和11.0下的粒徑分別為27（±22%）nm和15（±28%）nm。這可能是由于隨著反應(yīng)溶液pH值的升高，參與還原反應(yīng)的官能團(tuán)的去質(zhì)子化的能力增強(qiáng)。去質(zhì)子化的官能團(tuán)可以攜帶更多的負(fù)電荷，而這些負(fù)電荷可以把Ag＋還原為單質(zhì)Ag。另外，納米銀顆粒在高pH值條件下更穩(wěn)定是由于靜電排斥作用，這種作用可以使納米銀顆粒更分散不易團(tuán)聚［9］。這與紫外可見(jiàn)吸收光譜是一致的，即隨著pH值的增加，吸收峰出現(xiàn)了藍(lán)移。

圖1 不同pH值條件下合成納米銀的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.1 A UV－vis spectra of the silver nanoparticles synthesized at different pH values

圖2 在pH3.0和pH11.0條件下合成納米銀的TEM照片F(xiàn)ig.2 TEM images of the silver nanoparticles prepared at pH 3.0and 11.0

在溶液pH 2的條件下沒(méi)有納米銀合成，可能是因?yàn)樵谶@樣的強(qiáng)酸條件下，抑制了芒果皮提取物中還原基團(tuán)的活性。所以，pH值為11.0時(shí)，合成的納米銀形態(tài)最穩(wěn)定，粒徑最小。

2.2 芒果皮提取物不同添加量對(duì)納米銀合成的影響

芒果皮不同添加量對(duì)納米銀合成的影響如圖3。不同添加量下的吸收峰值見(jiàn)表1。

表1 芒果皮提取物不同添加量下的吸收峰值Table 1 Effects of the content of mango peel extract on the peak absorbance

隨著芒果皮提取物的添加量從0.1mL增加到3.0mL，紫外可見(jiàn)吸收峰值向長(zhǎng)波長(zhǎng)遷移，且峰變寬。這表明納米銀顆粒粒徑變大。通過(guò)TEM顯微照片（圖4）觀察納米銀顆粒為近似球形，其粒徑介于9nm（±24%）（0.1mL提取物）到15nm（±28%）（3.0mL提取物）之間。而相對(duì)應(yīng)的紫外可見(jiàn)吸收光譜的吸收峰值介于400nm到412nm之間。也就是說(shuō)吸收峰的位置隨粒徑的增大而向長(zhǎng)波移動(dòng)。這種紅移現(xiàn)象與納米銀和其周?chē)橘|(zhì)的介電常數(shù)的差值E有關(guān)，｜E｜越大，紅移越大。對(duì)于球形納米銀粒子，可以用球形勢(shì)阱模型從理論上解釋，由相鄰能級(jí)間隔公式△E＝－h(huán)2（X2n，1）／2μa2（a為球形納米銀粒子的半徑），可知能量差與粒子的半徑平方成反比，說(shuō)明粒子的半徑越大，能級(jí)間隔越小，其對(duì)應(yīng)的吸收峰中心波長(zhǎng)越長(zhǎng)。［10］

圖3 芒果皮提取物不同添加量下合成的納米銀的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.3 A UV－vis spectra of the silver nanoparticles synthesized at different mango peel extract content（mL）

圖4 芒果皮提取物添加量分別為0.1mL和3.0mL時(shí)合成的納米銀的TEM照片F(xiàn)ig.4 TEM images of the silver nanoparticles prepared at mango peel extract content of 0.1mL and 3.0mL

Song和Kim［6］在研究木蘭葉提取物合成納米銀時(shí)，也得到相似的結(jié)論，即納米銀的粒徑隨著提取物添加量的增加而變大。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)檩^多的還原基團(tuán)聚集在形成的原子核表面，這使得銀原子核表面的銀離子繼續(xù)被還原，納米銀的合成率增加，導(dǎo)致納米銀形成大粒徑粒子。另一方面，太多的還原物質(zhì)可以加強(qiáng)形成納米粒子間的橋聯(lián)效應(yīng)，這導(dǎo)致了納米粒子的團(tuán)聚。所以，為合成小粒徑的納米銀，應(yīng)選取最低芒果皮提取物添加量（0.1mL）。這證明芒果皮提取物的添加量也是決定納米粒子合成及合成粒徑的一個(gè)重要因素。

2.3 不同硝酸銀濃度對(duì)納米銀合成的影響

由圖5可見(jiàn)，隨著納米銀濃度從0.5mM增到4.0mM，吸收峰增高并且向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)（表2）。

表2 不同硝酸銀濃度下的吸收峰值Table 2 Effects of silver nitrate concentration on the peak absorbance

硝酸銀濃度分別為0.5mM和4mM時(shí)合成的納米銀的TEM照片顯示（圖6），納米銀的粒徑介于7nm（±23%）（0.5mM）和21nm（±17%）（4.0mM）之間。這可能是因?yàn)樘嗟募{米銀離子會(huì)富集在合成的原子核表面，在其表面又發(fā)生二次還原反應(yīng)，合成新的原子核，從而導(dǎo)致了大粒徑納米粒子的形成。所以，為了合成小粒徑的納米銀，需選取最適硝酸銀溶液濃度為0.5mM。

圖5 不同硝酸銀濃度下合成的納米銀的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.5 A UV－vis spectra of the silver nanoparticles synthesized at different silver nitrate concentration

圖6 硝酸銀濃度分別為0.5mM and 4mM時(shí)合成的納米銀的TEM照片F(xiàn)ig.6 TEM images of the silver nanoparticles prepared at silver nitrate concentration of 0.5mM and 4mM

2.4 納米粒子穩(wěn)定性測(cè)定

配置濃度為0.5mM的硝酸銀溶液。取29.9 mL與芒果皮提取物0.1mL混合，反應(yīng)溫度為80℃，時(shí)間為15min，pH 11.0。反應(yīng)生成納米銀后靜置3個(gè)月，期間連續(xù)觀察合成的納米銀粒子的紫外可見(jiàn)吸收峰，發(fā)現(xiàn)其吸收峰值均在402nm處，期間無(wú)明顯變化。說(shuō)明合成的納米銀粒子具有很好的穩(wěn)定性。

圖7 納米銀的X－射線圖譜Fig.7 XRD pattern of silver nanoparticles

2.5 納米銀的XRD表征

表征得到的納米銀的X射線衍射（XRD）圖譜峰位置與JCPDS卡上數(shù)據(jù)一致（JCPDS NO14－0781），特征值見(jiàn)圖7。圖中出現(xiàn)4個(gè)明顯的峰值，說(shuō)明納米銀晶體有4個(gè)晶面，衍射圖譜由4個(gè)不同半徑的同心圓環(huán)組成，對(duì)應(yīng)的晶面指數(shù)由里到外依次為（111）、（200）、（220）、（311）。經(jīng)比較 X射線衍射圖譜與Satishkumar和Bar［11，12］的研究一致。

2.6 納米銀的抑菌性

抑菌試驗(yàn)測(cè)得的抑菌圈直徑如表3所示，對(duì)照為芒果皮提取物，如表可見(jiàn)對(duì)照沒(méi)有抑菌性，而合成的納米銀溶液有明顯的抑菌圈，這說(shuō)明抑菌性來(lái)自于合成的納米銀溶液。由表可見(jiàn)大腸桿菌、葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為13.0 mm，14.5mm，11.0mm，這是因?yàn)槊糠N菌對(duì)納米粒子的感受性不同。就納米銀的抗菌機(jī)制而言主要有兩種：一種是接觸反應(yīng)，納米銀顆粒直接進(jìn)入菌體與氧代謝酶結(jié)合使菌體窒息而死。另一種是光催化反應(yīng)，在光的作用下，銀能起到催化活性中心的作用，激活水和空氣中的氧，產(chǎn)生羥基自由基和活性氧離子，活性氧離子具有很強(qiáng)的氧化能力，能在短時(shí)間內(nèi)破壞細(xì)菌的增殖能力而使細(xì)胞死亡［13］。

表3 納米銀的抑菌圈直徑Table 3 The results of antibacterial activity with zone of inhibition

3 結(jié)論與討論

采用芒果皮可以快速合成球形納米銀粒子。pH值、芒果皮提取物的添加量及硝酸銀溶液的濃度均是影響納米銀粒徑的重要因素。研究表明，pH值為11，芒果皮提取物的添加量為0.1mL，硝酸銀溶液濃度為0.5mM，反應(yīng)條件為80℃，水浴15min時(shí)，經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度法和TEM表征合成的納米銀的粒徑最小，為7nm（±23%）。穩(wěn)定性研究表明，生物法合成的納米銀粒子三個(gè)月內(nèi)均穩(wěn)定。XRD表征圖譜與已報(bào)道的納米銀圖譜一致。

本實(shí)驗(yàn)用生物法合成的納米銀具有良好的抑菌性。納米銀是一種廣譜、高效的抑菌劑，在食品行業(yè)中有較為廣泛的應(yīng)用前景，而生物法合成的納米銀清潔、無(wú)毒、環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展，并且反應(yīng)條件溫和是值得擴(kuò)大使用的抗菌產(chǎn)品。但是，納米銀的抑菌效果還受到食品組分、介質(zhì)等其他因素的影響，因此需要進(jìn)一步將其應(yīng)用到食品中試驗(yàn)其抑菌性能。

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