柳美玲，丁蓮，張小蘭

（中國農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術學院，北京 海淀100193）

基因的時空表達模式是探索基因功能的重要手段之一。雖然Northern雜交，半定量PCR（semi－quantitative PCR）、熒光定量 PCR（quantitative real－time PCR）以及免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）等方法都能對基因的表達水平進行檢測，但要想在顯微或亞顯微水平［1］上對基因的表達部位和表達時期上進行分析，這些方法都具有一定的局限性［2～4］。根據(jù)核酸分子雜交的基本原理和免疫組織化學的方法發(fā)展而來的RNA原位雜交技術（ISH ，in situ hybridization）［5，6］為我們提供了行之有效的途徑。

RNA原位雜交技術是分子生物學、組織化學以及細胞學相結合而產(chǎn)生的一門新興技術。它主要是利用堿基互補的原理，將體外合成的帶有標記的單鏈反義RNA與組織或細胞內(nèi)RNA靶序列雜交，將反義探針定位在特定基因的表達區(qū)域內(nèi)，從而可以了解組織或細胞內(nèi)RNA的分布和數(shù)量。

目前，RNA原位雜交技術在擬南芥和玉米上使用廣泛［7～9］，在煙草、水稻等植物中也 有涉及［10，11］，但是在園藝作物上的應用較少。本文結合擬南芥、玉米上的RNA原位雜交技術和自己的試驗經(jīng)驗，以黃瓜為例，對園藝作物RNA原位雜交技術方法進行優(yōu)化，并對其具體流程和注意事項進行闡述。

1 RNA原位雜交技術的操作流程

1.1 探針的制作

黃瓜原位雜交中一般使用地高辛標記的RNA探針，探針的長度在200～500bp比較合適，設計探針的時候應該盡量選擇mRNA的特異區(qū)域，如3′或5′UTR區(qū)。設計引物時在引物上下游分別加上SP6和T7聚合酶結合序列及保護堿基，通過PCR擴增后進行凝膠回收獲得至少2μg DNA產(chǎn)物。取2μg DNA加入200μL PCR管中，然后依次加入10xbuffer（2μL），10xlabeling mix （2μL），RNase inhibitor（1μL），RNApol（2μL，T7或SP6）和適量的H2O使得總體積為20μL，吸打混勻以后放入PCR儀中37℃溫浴2h進行反轉(zhuǎn)錄。

取1μL反轉(zhuǎn)錄合成的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測合成RNA的質(zhì)量（電泳槽用0.2mol·L－1NaOH 處理至少30min）。

在含有19μL RNA的PCR管中加入 H2O（75μL），100g·L－1tRNA （1μL），RNAse free DNAse（5U或1μL），放入PCR儀中37℃溫浴10 min。

加入等體積（95μL）4mol·L－1NH4Ac，2倍體積（190μL）酒精，于－20℃冰箱放置30min（亦可過夜）后，4℃離心15min，倒掉上清液，加入600μL 70% 酒精清洗兩次，4℃離心后盡量除掉殘余酒精，放在通風櫥中風干。

在裝有晾干沉淀的離心管中加入30μL H2O，混勻后測RNA的濃度，然后再加入70μL H2O和100μL 2xcarbonate緩沖液后置于60℃進行水解。水解時間T＝（起始片段長度－最終片段長度）／（k＊起始片段長度＊最終片段長度）；k＝0.11kb·min－1；最適宜終片段長度為150bp。

加入10μL 10% 冰醋酸 ，0.1倍體積的（21 μL）3mol·L－1NaOAc（pH 5.2），2倍體積的（420μL）酒精后于－20℃放置至少3h，也可過夜。然后4℃離心15min，倒掉上清液，加入600μL 70% 酒精清洗兩次，4℃離心后盡量除掉殘余酒精，放在通風櫥中風干。

在上一步得到的帶有沉淀的離心管中加入20μL H2O，混勻后測濃度，然后再加入20μL甲酰胺于－20℃冰箱保存。

1.2 斑點雜交——檢測探針的質(zhì)量

取出2μL探針在80℃金屬浴加熱2min進行變性反應，然后取其中的1μL稀釋20倍，將未稀釋和稀釋后的探針依次點到尼龍膜上形成一個個斑點。等斑點自然風干后進行交聯(lián)1min，然后將尼龍膜輕輕放入50mL的離心管中。使尼龍膜依次經(jīng)過以下溶液（溶液的量大約為30mL，以離心管平躺放置沒過尼龍膜為標準），并且以下步驟均在搖床上進行。

TBS 溶 液 （5min）——封 閉 緩 沖 液 （30 min）——1%BSA 0.3% 曲 拉 通 的 TBS 溶 液（TBST）（15min）——1／3000anti－DIG－AP的TBST溶液（90min，此步不在搖床上進行）——TBST溶液（3次，15min·次－1）——緩沖液C（5 min）——NBT／BCIP 顯色液（10～30min）

根據(jù)染色的深淺評價探針的濃度并初步確定雜交時探針的稀釋倍數(shù)。如圖1。

圖1 斑點雜交效果圖Fig.1 Result of Dot blot

1.3 樣品的準備

第一天（冰上）：取樣，將樣品放在3.7%FAA（用DEPC水配制）中，抽真空直到樣品全部沉入瓶底，然后更換新鮮的FAA，4℃搖床上震蕩過夜。

第二天（4℃搖床上）：將樣品經(jīng)過酒精梯度進行脫水，每次180min。過酒精梯度時可以在溶液里面加入幾滴1%的甲基曙紅染色以方便后面的包埋。酒精梯度依次是50%酒精＋10%的8.5%NaCl，70%酒精＋10%的8.5%NaCl，85%酒精＋10%的8.5%NaCl，95%酒精，100%酒精。最后，再更換新鮮的100%酒精（不用加甲基曙紅），于4℃搖床上過夜。

第三天（室溫搖床上）：換新鮮的100%酒精于室溫放置2.5h，然后更換酒精∶脫蠟劑＝1∶1溶液放置1.5h，連續(xù)換4次脫蠟劑，每次1.5h，在換最后一次脫蠟劑的時候加入約1／4體積的固體石蠟片于常溫過夜。

第四天：將樣品轉(zhuǎn)移到42℃烘箱中，等石蠟片全部融化以后更換新鮮的液體石蠟于60℃烘箱過夜（液體石蠟最好提前一天放在60℃烘箱融好備用）。

連續(xù)換3天純液體石蠟，每天早晚各一次，在第四天早晨換完純蠟至少等待4h以后開始包埋。

從包埋盒中取出已經(jīng)包埋好的蠟塊，用加熱的刀片或者解剖刀將蠟塊切成若干小蠟塊，分開的每個小蠟塊中包含一個完整的組織，然后用刀片切除多余的石蠟，將小蠟塊修整成正方體或者長方體后將其粘在小木塊上。

然后，使用切片機進行切片，切片的厚度一般在8～12μm，切下的片子往往帶有皺褶，因此還需要展片，用毛筆挑取石蠟片，放在攤片機上用37℃的DEPC水展片，等到石蠟片充分展平以后，用載玻片在水中撈取石蠟片，然后用吸水紙吸干多余的水分，將載玻片置于37℃的烤片機上烤片12～36h。由于組織切片要在各種溶液中反應時間較長，因此粘片一定要牢固，我們使用的載玻片是Fisher Scientific公司的，由于這些載玻片經(jīng)過硅化處理，表面的疏水性較強，因此從水中撈取石蠟片以后一定要將多余的水分充分吸干，以免影響粘片的效果。

1.4 預雜交和雜交

1.4.1 預雜交

將選好的石蠟切片依次經(jīng)過以下溶液（將500mL溶液倒入一個約600mL的玻璃缸中，如圖2A，將選好的片子放入金屬玻片架中，如圖2C，然后將玻片架放入玻璃缸中進行以下試驗，如圖2B）。

圖2 原位雜交所用耗材Fig.2 Consumables of the in situ hybridization

脫蠟劑（2次，10min·次－1）——100%酒精（2次，1min·次－1）——95%酒精（30s）——85%酒精，0.85%NaCl（30s）——70% 酒精，0.85%NaCl（30s）——50%酒精，0.85%NaCl（30s）——30%酒精，0.85%NaCl（30s）——0.85%NaCl（2min）——PBS（2min）－ 蛋白 酶 K 溶液 （30 min，37℃）——0.2% 甘 氨 酸 的 PBS 溶 液 （2 min）——PBS（2次，2min·次－1）－4%甲醛的PBS溶液（10min，磁力攪拌器攪拌）——PBS（2次，2min·次－1）——乙酸酐溶液（10min，pH＝8，磁力攪拌器攪拌）——PBS（2次，2min·次－1）－0.85%NaCl（2min）——30%酒精，0.85%NaCl（30s）——50%酒精，0.85%NaCl（30s）——70%酒精，0.85%NaCl（30s）——85% 酒精，0.85%NaCl（30s）——95%酒精（30s）——100%酒精（1 min）——100%酒精（1min，少量）。

樣品可于裝有少量100%酒精玻璃缸中存放數(shù)小時，待酒精揮發(fā)完全即可進行下面的實驗。

1.4.2 雜交

依據(jù)斑點雜交結果將探針稀釋于50%甲酰胺溶液中。探針和雜交液的總用量以能覆蓋所有的組織為標準，一般每張載玻片用量為150μL，探針和雜交液的體積比為1∶4，將探針雜交液加到載玻片上以后，用槍頭輕輕將其攤開，蓋上蓋玻片，盡量避免氣泡，置于有由2×SSC／50%甲酰胺浸濕的吸水紙的托盤中，密封放于50℃烘箱中過夜。雜交過程涂完探針雜交液后，蓋蓋玻片的時候一定要注意盡量避免產(chǎn)生氣泡，氣泡的存在會直接影響雜交的質(zhì)量。另外，雜交反應過程一定要保持一定的濕度，由于雜交反應需要過夜，時間較長，因此2×SSC／50%甲酰胺溶液的用量適量增加以防第二天變干。

1.5 洗片以及顯色

在55℃0.2×SSC溶液中將蓋玻片洗掉，然后依次經(jīng)過以下溶液：55℃0.2×SSC溶液（2次，1 h·次－1）——37℃ NTE 溶 液 （2 次，5min·次－1）——37℃20μg·mL RNAse A 的 NTE溶液（30min）——37℃ NTE 溶液（2次，5min·次－1）——55℃0.2×SSC溶液（1h）－TBS溶液（5min）——羅氏封閉液（45min，搖床）——TBST溶液（45min）。將抗體用TBST溶液稀釋1250倍涂于樣品上，避光保濕室溫放置2h。

之后，用TBST溶液清洗4次，每次15min，然后再用緩沖液C（鮮配）清洗5min，最后加NBT／BCIP進行顯色，顯色的過程一定要避光。1－3天后用TE緩沖液洗片，置于顯微鏡下觀察。最后用封片劑封片，長期保持。

1.6 部分溶液配方

2xcarbonate緩沖液：80mmol·L－1NaHCO3，120mmol·L－1Na2CO3

FAA（3.7%）：50%酒精，5%冰醋酸，3.7%甲醛

蛋白酶 K 溶液：100mmol·L－1Tris pH8溶液，50mmol·L－1EDTA。先在37℃預熱，使用之前加入1μg·mL－1蛋白酶K即可。

乙酸酐溶液：3mL乙酸酐加入600mL 0.1 mol·L－1triethanolamine－HCl，然后再用 NaOH調(diào)溶液的酸堿度到pH＝8.

TBST溶液：1%BSA，0.3% 曲拉通 X－100，1XTBS，60℃攪拌助溶。

雜交液：0.3mol·L－1NaCl，10mmol·L－1Tris－HCl pH6.8，10mmol·L－1NaHPO4pH6.8，5mmol·L－1EDTA，50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，1×Dernhardts，1g·L－1tRNA。

緩沖液 C：100mmol·L－1Tris－HCL（pH 9.5），50mmol·L－1MgCl2，100mmol·L－1NaCl

2 注意事項

2.1 樣品選擇

RNA原位雜交技術對幼嫩組織比較適用，很老的組織如葉片、粗壯的莖等很難取得好的雜交結果。因此，在樣品的選擇上盡量選用幼嫩組織和部位。

2.2 樣品固定

因園藝作物鮮嫩多汁，水分含量多，如黃瓜的果實，樣品固定時酒精梯度可加密，通常增加30%和60%兩個梯度。并且，每個酒精梯度固定時間也可適當延長到3h。

2.3 切片厚度

大多做RNA原位雜交的切片厚度是8～12 μm，但對特殊樣品，如黃瓜上的果刺細胞，因其細胞大，水分多，切片厚度可增加到20μm。

RNA原位雜交使用的是RNA探針，合成RNA探針最關鍵的是防止RNase污染，因此整個RNA原位雜交流程（除洗片和顯色外）用到的耗材都要進行DEPC處理以去除RNase。

由于整個過程步驟多耗時長，操作時動作要輕，避免破壞樣品的完整性。

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