那 鍵，馬 超，霍維玲，秦瑞云，許 永，王 濤，吳曉東，谷貴山

（1.江蘇省徐州市中心醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，江蘇 徐州 221009；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，吉林 長春 130021）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性Wistar大鼠乳鼠40只

（出生48h以內(nèi)），吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 茜素紅（北京中山生物技術(shù)公司），臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），倒置相差顯微鏡（NIKON公司），ELISA酶標(biāo)儀（美國ELx800），β－甘油磷酸鈉、地塞米松和維生素C（美國Sigma公司），堿性磷酸酶免疫組織化學(xué)試劑盒（南京建成生物制品有限公司），Ⅱ型膠原酶和胎牛血清（北京鼎國生物技術(shù)公司），高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）

1.3 顱骨來源成骨細(xì)胞分離 將大鼠乳鼠拉頸處死，75%乙醇中浸泡10min，在超凈工作臺(tái)中無菌條件下平皿內(nèi)取出顱骨，仔細(xì)剔除表面附著軟組織，剔除骨縫之間軟骨，用PBS浸泡沖洗3次，至骨塊發(fā)白透亮，用眼科剪刀將其剪成1mm×1mm×1mm左右碎塊。再加入10倍體積的0.25%胰蛋白酶，37℃水浴箱內(nèi)置20min，每10min搖晃1次以消化掉纖維組織、成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞，共2次，去除懸液，因?yàn)閼乙豪锖写罅肯聛淼某衫w維細(xì)胞。然后再加入2倍體積的Ⅱ型膠原酶消化。在37℃水浴箱中1h，過200目篩網(wǎng)去除碎骨塊，細(xì)胞懸液以1 000r·min－1離心5min，收集消化液中的細(xì)胞，PBS漂洗后接種于25cm2培養(yǎng)瓶，加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。膠原酶消化及提取細(xì)胞步驟重復(fù)4次。2～3d換液待細(xì)胞近鋪滿全瓶后傳代。

1.4 細(xì)胞的傳代培養(yǎng) ①細(xì)胞融合后棄培養(yǎng)液，用PBS清洗3次；②用0.25%胰蛋白酶（含0.01%EDTA）1mL消化細(xì)胞，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2min，顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增大時(shí)，輕輕振動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞脫壁，加入10%胎牛血清終止消化；③用吸管吸取瓶中培養(yǎng)基按一定順序沖洗瓶壁，使全部細(xì)胞脫壁形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液移入離心管20℃、1 200g離心10min；④棄上清液，加1mL培養(yǎng)基用吸管反復(fù)吹打瓶壁，重懸細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105mL－1，取0.1mL細(xì)胞懸液移入50mL培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2濕化空氣的孵箱中進(jìn)行靜置培養(yǎng)。此為第1代成骨細(xì)胞。傳代過程中每2～3d換液1次，直到細(xì)胞彼此匯合鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底，然后按1∶2的量接種培養(yǎng)，為第2代大鼠成骨細(xì)胞，依此類推。

1.5 體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞純化 采用差速黏附的方法來純化細(xì)胞：利用成纖維細(xì)胞比成骨細(xì)胞更易黏附到瓶壁的特點(diǎn)將消化下來含成纖維細(xì)胞的懸液接種到培養(yǎng)瓶中，靜置20min左右，輕輕吸取上清液到另一培養(yǎng)瓶中，20min后再將培養(yǎng)液吸出接種于第3個(gè)培養(yǎng)瓶中，形成的細(xì)胞懸液中即為純化的成骨細(xì)胞。每次傳代時(shí)均用此法純化成骨細(xì)胞。

1.6 大鼠顱骨來源成骨細(xì)胞鑒定 ①生長情況和形態(tài)學(xué)觀察：每天觀察培養(yǎng)的原代及傳代大鼠成骨細(xì)胞測(cè)定其生長情況（MTT法），繪制細(xì)胞生長曲線，同時(shí)用倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)的變化。傳代細(xì)胞以1×104接種于96孔板，每孔加入常規(guī)成骨細(xì)胞培養(yǎng)液180μL，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)孔。每天檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前4h加 MTT（5g·L－1），20μL/孔，檢測(cè)時(shí)加DMSO，150μL/孔，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（A）值（波長為490nm）。繪制細(xì)胞生長曲線。②蘇木精染色觀察：取第3代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行蘇木精染色，用PBS洗3次；4%多聚甲醛固定10min，雙蒸水沖洗；加蘇木精染液5min，鹽酸酒精分色，流動(dòng)自來水沖洗3min，藍(lán)化、雙蒸水浸洗5min，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固。③堿性磷酸酶（ALP）染色（改良Kaplow氏法）：成骨細(xì)胞可以特異性形成ALP，成骨細(xì)胞融合成層后，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的ALP，通過ALP染色可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用改良Kaplow法染色對(duì)所誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞形成ALP能力進(jìn)行測(cè)定。將第3代細(xì)胞接種于有鈣玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至形成結(jié)節(jié)后取出，PBS沖洗，甲醛固定液固定10min，蒸餾水沖洗數(shù)次晾干，滴加新鮮配制的底物液蓋滿樣本部分加封口膜，37℃孵育液中15min（現(xiàn)用現(xiàn)配），蒸餾水沖洗數(shù)次，用蘇木素復(fù)染3min，蒸餾水洗數(shù)次晾干。④礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色：該染色法是鑒別成骨細(xì)胞的特異性染色法。連續(xù)培養(yǎng)25d的細(xì)胞爬片，PBS洗3次，95%乙醇固定10min，水洗后，用飽和茜素紅染色30min，水洗，乙醇脫色，二甲苯透明，樹膠封片后觀察。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞的一般形態(tài)學(xué)觀察 剛分離的原代細(xì)胞貼壁前是均勻一致的小球形，折光性強(qiáng)，大小不一，細(xì)胞周圍有光暈，細(xì)胞核偏于一側(cè)，可見清晰的核仁。接種24h后可見部分圓形細(xì)胞以散在的方式貼壁，貼壁細(xì)胞有小的突起，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞伸出較多突起，有的突起相互連接。48～72h細(xì)胞完全貼壁伸展成飽滿多角狀，成多個(gè)集落。7～8d時(shí)集落迅速增多。至10～15d細(xì)胞約進(jìn)入快速生長期，集落中心細(xì)胞密集，周圍細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀排列，細(xì)胞之間無接觸抑制現(xiàn)象，集落間出現(xiàn)重疊，各集落的大小、細(xì)胞的疏密程度和細(xì)胞排列方式不盡相同。15～20d細(xì)胞融合，細(xì)胞重疊復(fù)層生長。傳代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞其形態(tài)呈現(xiàn)出不規(guī)則多角形，多為不規(guī)則三角形或四邊形，細(xì)胞表面有短而薄的突起。蘇木精染色顯示：細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面有長的突起，細(xì)胞之間連接成網(wǎng)狀，細(xì)胞核橢圓形，核仁1～2個(gè)（圖1，見封三）。

2.2 成骨細(xì)胞成骨特性的鑒定 ①ALP染色：經(jīng)ALP染色后，細(xì)胞漿為紫黑色，并可見大量紫黑色顆粒。約80%以上的細(xì)胞呈陽性（圖2A，見封三）。②礦化結(jié)節(jié)染色：經(jīng)礦化結(jié)節(jié)染色后，可見胞外基質(zhì)中的紅色礦化結(jié)節(jié)（圖2B，見封三）。

2.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞的增殖結(jié)果 第3代細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的 “S”型，有明顯的對(duì)數(shù)生長期及平臺(tái)期，符合成骨細(xì)胞生長規(guī)律（圖3）。

圖3 大鼠顱骨來源第3代成骨細(xì)胞生長曲線Fig.3 The growth curve of osteoblasts at the 3rd generation from rat skull

3 討 論

成骨細(xì)胞在體內(nèi)能合成和分泌膠原、糖蛋白等類骨質(zhì)成分，參與類骨質(zhì)的鈣化過程，是體內(nèi)參與骨形成過程的主要細(xì)胞[1]，是體外成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的主要細(xì)胞來源。1974年Birlderraan詳述了成骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)和初步鑒定方法，此后體外成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)方法逐漸發(fā)展成型[2]。

目前從骨組織獲取成骨細(xì)胞的方法主要有酶消化法和組織塊培養(yǎng)法，酶消化法是將骨組織塊經(jīng)酶消化處理后收集細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，一次可獲較多量細(xì)胞，是目前較常用方法。有研究證實(shí)：骨組織中各種細(xì)胞耐受消化酶能力依次為：成纖維細(xì)胞＜破骨細(xì)胞＜骨祖細(xì)胞＜成骨細(xì)胞。分步酶消化法可將首次消化獲得的細(xì)胞拋棄，以減少首先消化下來的成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞等的污染，再行消化可收集到較純的成骨細(xì)胞。常用的消化酶主要有胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶。由于成骨細(xì)胞比較脆弱，故培養(yǎng)難度較大，如何獲得大量優(yōu)質(zhì)的原代來源成骨細(xì)胞是一個(gè)有挑戰(zhàn)性的難題。本實(shí)驗(yàn)對(duì)酶消化法進(jìn)行改良取得了理想的效果。

本研究中組織來源為出生24～48h內(nèi)雌性大鼠乳鼠顱骨，優(yōu)點(diǎn)是成骨細(xì)胞較多，細(xì)胞活力強(qiáng)，且骨組織易于處理。取顱骨時(shí)應(yīng)注意剔除骨膜及周圍透明軟骨結(jié)節(jié)，以減少雜質(zhì)細(xì)胞的污染。為了保證成骨細(xì)胞活性，所有操作過程應(yīng)在冰盒上進(jìn)行。

傳統(tǒng)的胰蛋白酶消化處理時(shí)間為1h甚至更長，Ⅱ型膠原酶過夜消化，實(shí)踐證明這種方法容易損傷細(xì)胞膜表面受體和抗原成分，細(xì)胞成活率低或者細(xì)胞功能受損。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)消化的時(shí)間及方法進(jìn)行了改良，視骨組織塊大小靈活掌握消化時(shí)間，盡量將胰酶作用時(shí)間控制在30min以內(nèi)，如果切成乳糜狀，胰蛋白酶消化時(shí)間應(yīng)該小于20min，消化1次即可去除雜質(zhì)細(xì)胞，過長時(shí)間的消化導(dǎo)致骨組織上的需要的成骨細(xì)胞數(shù)量過少且功能受損，二次膠原酶消化后成骨細(xì)胞成活率很低往往導(dǎo)致失敗。如果骨塊在1mm×1mm×1mm左右，則胰蛋白酶可以每次消化25～30min，連續(xù)消化2次，以徹底消化去除非目的細(xì)胞。有報(bào)道稱Ⅱ型膠原酶對(duì)細(xì)胞無明顯影響，故本實(shí)驗(yàn)初期做膠原酶過夜消化，結(jié)果細(xì)胞數(shù)量很多，但成活率很低，很多細(xì)胞無法貼壁。本實(shí)驗(yàn)采取的辦法是Ⅱ型膠原酶消化1h，每隔1h收集1次細(xì)胞，更換膠原酶繼續(xù)消化1h，獲得大量優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞。

獲取的原代細(xì)胞最好采用一次性的塑料培養(yǎng)瓶，因其帶有負(fù)電荷細(xì)胞容易貼壁生長。使用前要預(yù)加入培養(yǎng)液培養(yǎng)1h。細(xì)胞接種后可采用差速貼壁法提純成骨細(xì)胞。因?yàn)槌衫w維細(xì)胞先貼壁，所以傳代后靜置20min時(shí)成纖維細(xì)胞已經(jīng)貼壁，將仍未貼壁的成骨細(xì)胞接種至另一培養(yǎng)瓶。另外每次換液時(shí)要輕輕搖晃培養(yǎng)液以倒掉非貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞。

成骨細(xì)胞體外生長大致經(jīng)過快速增殖、細(xì)胞外基質(zhì)形成和基質(zhì)礦化3個(gè)生長階段。本研究結(jié)果證實(shí)：體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)約6～7d后細(xì)胞完全貼壁進(jìn)入快速增殖期；當(dāng)細(xì)胞生長至單層融合狀態(tài)時(shí)分裂速度減慢，不傳代細(xì)胞成集落分層生長，Ⅰ型膠原等骨基質(zhì)成分分泌活躍，3～5周時(shí)終基質(zhì)鈣化結(jié)節(jié)形成。Sudo等[3]報(bào)道：體外培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞可產(chǎn)生特異性鈣化，這是鑒定成骨細(xì)胞的重要依據(jù)，體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在有維生素C和β－甘油磷酸鈉的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)生長時(shí)，促進(jìn)了鈣鹽沉積[4]，有利于礦化結(jié)節(jié)形成。

對(duì)于成骨細(xì)胞分化成熟的調(diào)節(jié)是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)明確的因素包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）[5]、細(xì)胞生長因子、激素和機(jī)械物理等。最新研究[6－7]表明：微孔鈦絲可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化及成熟，Wnt5a蛋白可以增加BMP2、BMP4和BMP7表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及成熟，氨基丁酸可以通過下調(diào)BMP2及RANKL表達(dá)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化而減少成骨細(xì)胞分化及成熟[8]。鈣離子和硅酸根離子[9]、13－93玻璃纖維[10]及聚磷腈[11]在體內(nèi)外對(duì)成骨細(xì)胞分化成熟均可起正向調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)可獲得純度較高的體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞，并且具有典型成骨細(xì)胞的生物學(xué)特征，本研究為體外原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞提供一種合理、有效的方法。

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