方 珍，鞠 文，秦亞楠，孟日增，3，潘風(fēng)光

（1.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院食品質(zhì)量與安全教研室，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，吉林 長(zhǎng)春 130062）

O

157∶H7是大腸桿菌中重要血清型，其感染劑量極低，一次攝入10個(gè)活菌就可致病[1]。因此，做好食品中E.coliO157∶H7的檢測(cè)具有重要的意義。微生物檢測(cè)方法很多，包括細(xì)菌培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法及酶聯(lián)免疫吸附法等，但均 有 不 足 之 處[2－5]。 免 疫 熒 光 技 術(shù)（immunof1uorescence technique）是用熒光素標(biāo)記的抗體檢測(cè)抗原或抗體的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)，又稱熒光抗體技術(shù)。所用的熒光素標(biāo)記抗體通稱為熒光抗體，系由熒光素 （常用異硫氰基熒光素，fluorecein isothiocyante，F(xiàn)ITC），以化學(xué)方法與效價(jià)較高、活性較強(qiáng)的抗體共價(jià)結(jié)合后制備而成[6]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于FITC標(biāo)記蛋白應(yīng)用于免疫熒光檢測(cè)早有報(bào)道，但對(duì)于E.coliO157∶H7免疫熒光檢測(cè)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)的關(guān)鍵在于制備純度高、效價(jià)高、特異性好、穩(wěn)定性好的熒光素標(biāo)記抗體，完成抗體的前期準(zhǔn)備，對(duì)于E.coliO157∶H7免疫熒光檢測(cè)方法的建立具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)旨在制備高效價(jià)高純度的E.coliO157∶H7多克隆抗體，通過(guò)優(yōu)化FITC標(biāo)記抗體的條件，制得能廣泛適用于E.coliO157∶H7免疫熒光檢測(cè)的FITC標(biāo)記多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株及試劑 新西蘭大耳兔7只，體質(zhì)量約2.5kg，購(gòu)自長(zhǎng)春市生物制品所。大腸桿菌O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌株由吉林出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心微生物實(shí)驗(yàn)室保存。FITC（美國(guó)Sigma公司），SDS-PAGE試劑盒、BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒（康為世紀(jì)公司），HiTrap Protein G純化柱（美國(guó)GE公司）。

1.2E.coli多克隆抗體的制備 ①抗原的制備：標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌O157∶H7菌株于LB培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)8h，離心棄培養(yǎng)基，生理鹽水洗3次，計(jì)數(shù)。甲醛滅活后超聲破碎1h。② 抗血清制備：按傳統(tǒng)方法制備疫苗，取菌量為2×108cfu的疫苗對(duì)家兔進(jìn)行背部多點(diǎn)免疫4次。頸動(dòng)脈無(wú)菌采血，分離免疫血清，間接ELISA法測(cè)定效價(jià)[7－8]。

1.3 抗體的純化 采用辛酸－飽和硫酸銨法粗提抗體IgG[9－10]，所 得 蛋 白 經(jīng) 0.22μm 過(guò) 濾，采 用HiTrap Protein G蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步純化，通過(guò)按5%梯度增加蛋白洗脫液的方法確定最佳洗脫方法。純化效果通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳法（SDS-PAGE）進(jìn)行驗(yàn)證。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定抗體蛋白濃度。

1.4 FITC標(biāo)記多克隆抗體的制備 取抗體蛋白總量為1mg適量體積溶液，用pH 9.0的碳酸鹽緩沖液對(duì)抗體溶液進(jìn)行透析，使蛋白處于堿性環(huán)境。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇標(biāo)記條件[11－12]。①確定最佳反應(yīng)比值：按照FITC與蛋白含量比值分別為1∶20、1∶10、3∶20計(jì)算FITC用量，逐滴加入溶于二甲基亞砜的FITC，室溫避光反應(yīng)4h，進(jìn)行FITC標(biāo)記。②確定最佳標(biāo)記抗體反應(yīng)條件：由所得到的最佳比值計(jì)算FITC用量，按照反應(yīng)條件為4℃、2h，20℃、4h，37℃、30min，進(jìn)行FITC標(biāo)記。反應(yīng)后液體用超濾離心管6 000r·min－1離心20min，反復(fù)多次，收集每次離出液，測(cè)定熒光值（F485/535），直至離出液無(wú)熒光值。測(cè)定標(biāo)記后F485/535值，結(jié)合顯著性差異分析及實(shí)際情況，得到最佳FITC與抗體含量比值和反應(yīng)條件。

1.5 熒光標(biāo)記抗體與混合菌液反應(yīng) 取E.coliO157∶H7活菌液100μL與S.aureus混勻，滴至載玻片上，火焰固定30s自然風(fēng)干后分別滴加10倍比稀釋的FITC標(biāo)記多克隆抗體50μL，滴加伊文氏蘭染液覆蓋染色15min，蒸餾水洗滌干凈后于熒光顯微鏡下觀察熒光抗體與菌液反應(yīng)的結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，F(xiàn)485/535以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果 4次免疫后效價(jià)見(jiàn)圖1。第2、3、4號(hào)兔血清1∶25 600稀釋時(shí)，A450≥2.1倍陰性對(duì)照值，故選擇2、3、4號(hào)兔進(jìn)行純化制備多克隆抗體。

圖1 每次免疫后兔血清效價(jià)結(jié)果Fig.1 The antibody titers of rabbit serum after every immunization

2.2 多克隆抗體的純化結(jié)果 經(jīng)辛酸－飽和硫酸銨法粗提的血清由5%梯度洗脫，結(jié)果見(jiàn)圖2。收集100%洗脫液洗脫蛋白，即第3峰值所得蛋白由超濾離心管濃縮，SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖3，經(jīng)35%、100%梯度洗脫所得抗體蛋白條帶出現(xiàn)在55 000與20 000處，與文獻(xiàn)[13]相符，說(shuō)明所得為多克隆抗體IgG。濃縮后抗體蛋白含量由BCA試劑盒測(cè)定結(jié)果為23.6g·L－1。

2.3 多克隆抗體特異性檢測(cè) 應(yīng)用間接ELISA法測(cè)定多克隆抗體特異性，以未免疫健康兔血清為陰性對(duì)照。所制多克隆抗體與9種腸桿菌反應(yīng)測(cè)得A450（測(cè)定值－PBS對(duì)照孔值）分別為：沙門(mén)氏菌0.095，陰溝腸桿菌0.084，克雷伯桿菌0.091，糞腸球菌0.084，坂崎腸桿菌0.103，黏質(zhì)沙雷桿菌0.071，奇異變形桿菌 0.079，單增李斯特菌0.104，E.coliO157∶H7 1.2，陰性 血清對(duì)照0.069。所制得多克隆抗體與大腸桿菌O157∶H7外其他8種腸桿菌無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。

圖2 不同濃度洗脫液進(jìn)行HiTrap Protein G純化多克隆抗體結(jié)果Fig.2 The results of purified polyclonal antibody under the different doses of elution conditions

圖3 不同條件純化蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 The SDS-PAGE results of purified protein under different conditions

2.4 多克隆抗體FITC標(biāo)記結(jié)果 應(yīng)用不同F(xiàn)ITC∶抗體蛋白含量對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，測(cè)定5次所得標(biāo)記抗體的 F485/535分別是：1∶20為58 207.00±8.27，1∶10 為 71 368.00±2.38，3∶20為78 231.00±8.63。在不同反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度條件下測(cè)定5次所得標(biāo)記抗體的F485/535值分別是：4℃、2h為70 912.00±6. 41；20℃、4h為70 781.00±8. 30；37℃、30min為71 094.00±3.65。對(duì)3組不同F(xiàn)ITC∶抗體蛋白含量比值條件進(jìn)行標(biāo)記所得F485/535進(jìn)行兩兩比較，F(xiàn)ITC∶蛋白含量為1∶10與1∶20所得標(biāo)記產(chǎn)物F485/535值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)ITC∶蛋白含量為1∶10與3∶20所得標(biāo)記產(chǎn)物F485/535值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 熒光標(biāo)記抗體反應(yīng)觀察結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記抗體與混合菌液反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)圖4。無(wú)熒光照射下混合菌液，菌體由于伊文氏蘭染色顯示紅色（圖4A，封三）。1∶1 000倍稀釋熒光抗體與菌液反應(yīng)，在中度熒光強(qiáng)度照射下15min時(shí)，由于S.aureus無(wú)熒光標(biāo)記，無(wú)法在視野下觀察到（圖4B，見(jiàn)封三）。

圖4 顯微鏡下抗體與E.coli O157∶H7和S.aureus混合液反應(yīng)觀察結(jié)果Fig.4 The observation results of the reaction of antibody with mixed liquid of E.coli O157∶H7and S.aureus under microscope

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用HiTrap Protein G進(jìn)行抗體純化過(guò)程中創(chuàng)新性地采用了梯度增加洗脫液的方法，血清在由35%洗脫液沖洗條件下即可出現(xiàn)峰值，且由間接ELISA驗(yàn)證與抗原無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)；將35%、100%洗脫液洗脫蛋白與100%洗脫液直接洗脫蛋白行SDS-PAGE對(duì)比純化效果，經(jīng)改進(jìn)后即35%、100%洗脫的HiTrap Protein G蛋白純化方法所得多克隆抗體條帶數(shù)目更少、目的條帶更清晰，說(shuō)明改進(jìn)后得到抗體比直接洗脫效果更好，其原因可能為少量與IgG蛋白性質(zhì)相近的蛋白可被純化柱所吸附，在35%洗脫液條件下（pH約為4.3）即被洗脫，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。與已有文獻(xiàn)報(bào)道的其他抗體純化效果比較，應(yīng)用此法純化抗體所得純度明顯高于辛酸－飽和硫酸銨提取法[14]、抗原吸附法[14]及 DEAE-Sephadex A50親和層析法[15]，且Protien G柱可重復(fù)利用，不同種類抗體可共用一個(gè)純化柱，降低了純化成本；純化系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)液與收集，電腦操作降低了人力消耗，操作簡(jiǎn)便。因此，此改進(jìn)純化方法即HiTrap Protein G 35%、100%二梯度洗脫效果較好，可推廣應(yīng)用于抗體純化。

本研究結(jié)果顯示：考慮到節(jié)約標(biāo)記成本及后期FITC更易去除完全的原因，選擇標(biāo)記時(shí)FITC與蛋白量最佳比值為1∶10；在3種反應(yīng)條件下，反應(yīng)得到的熒光值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同標(biāo)記時(shí)間與標(biāo)記溫度下所得標(biāo)記抗體的F485/535值接近，無(wú)需做差異性分析，即3種不同反應(yīng)條件均對(duì)FITC標(biāo)記無(wú)影響?？紤]到抗體在低溫下最易保持其與抗原反應(yīng)的能力，本文作者將標(biāo)記后抗體稀釋1 000倍與抗原反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：37℃條件下標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合相對(duì)較少，菌體熒光不及其他條件下明亮，故不選擇37℃、30min作為最佳反應(yīng)條件；同時(shí)，由于4℃條件下進(jìn)行攪拌反應(yīng)需要具備的實(shí)驗(yàn)環(huán)境較難達(dá)到，且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，故選擇20℃、2h作為最佳FITC標(biāo)記反應(yīng)條件。

本實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)抗體不與S.aureus發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，也無(wú)明顯熒光素吸附雜蛋白及目標(biāo)菌之外其他菌體的情況發(fā)生，說(shuō)明所制備的FITC標(biāo)記多抗抗性良好、抗體純度高、熒光強(qiáng)度高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、特異性好，可應(yīng)用于免疫熒光法檢測(cè)E.coliO157∶H7。

綜上所述，免疫熒光檢測(cè)因其操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏性良好及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為致病菌定性檢測(cè)的一種重要方法。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了抗體純化技術(shù)，優(yōu)化了FITC標(biāo)記抗體的條件，制備出的FITC標(biāo)記抗體熒光強(qiáng)度高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，特異性良好，為建立E.coliO157∶H7免疫熒光檢測(cè)方法完成了關(guān)鍵步驟。

[1]楊小鵑，吳清平，張菊梅，等.動(dòng)物性食品中大腸桿菌O157∶H7多重PCR檢測(cè)方法的建立 [J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（11）：1951-1953.

[2]宋宏新，李 宏，邢 佩.食品中大腸桿菌O157∶H7的選擇性培養(yǎng)與檢測(cè)方法研究 [J].陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26（1）：64-67.

[3]Ghinwa NJ，Pierre B，Julie C，et al. Activation of nanoparticles by biosorption forE.colidetection in milk and apple juice [J].Appl Biochem Biotechnol，2010，162（2）：460-475.

[6]趙志晶，劉秀梅.出血性大腸桿菌單克隆抗體的制備與鑒定 [J].衛(wèi)生研究，2002，31（2）：108-111.

[4]余 抒，羅 萍，陳洪章，等.抗腸出血性大腸桿菌O157∶H7EspA單克隆抗體的制備及其特性鑒定 [J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23（7）：657-659.

[5]陳慶森，馮永強(qiáng)，黃寶華，等.食品中致病菌的快速檢測(cè)技術(shù)的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展 [J].食品科學(xué)，2003，24（11）：148-152.

[6]Huang B，Yin Y，Lu L，et al.Preparation of high-affinity rabbit monoclonal antibodies for ciprofloxacin and development of an indirect competitive ELISA for residues in milk [J].Zhejiang Univers Sci B，2011，11（10）：812-818.

[7]Balvinder KM，Minakshi P，Baldev RG，et al.Comparative efficacy of immunological，molecular and culture assays for detection of group A rotavirus from faecal samples of buffalo（Bubalus bubalis）calves [J].Trop Anim Health Prod，2010，42（8）：1817-1820.

[8]閆東明，于師宇，任洪林，等.石房蛤毒素單克隆抗體的制備及其特性研究 [J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（3）：73-76.

[9]王志祥，王靜梅，王耀峰.單核增多性李氏桿菌多克隆抗體的制備及純化 [J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，7（1）：4-6.

[10]武 薇，韓克光.兩種方法純化兔抗綿羊肺炎支原體IgG的比較 [J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2010，27（2）：31-32.

[11]李 錚，褚麗蕓，鄭愛(ài)萍.FITC標(biāo)記胰島素的合成、純化及表征 [J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2011，16（9）：8-10.

[12]唐惠玲，陳 濤，王 瑩，等.蟲(chóng)草多糖熒光標(biāo)記的方法學(xué)研究 [J].藥學(xué)與臨床研究，2010，18（3）：279-281.

[13]劉生杰，余為一.免疫球蛋白IgG和IgM分離純化技術(shù)現(xiàn)狀與展望 [J].阜陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，23（3）：27-31.

[14]郎 婧，金 敏，王新為，等.大腸桿菌O157∶H7多克隆抗體純化 [J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，26（4）：238-241.

[15]吳曉萍，廖愛(ài)琳，章超樺，等.企鵝珍珠貝鎘金屬硫蛋白的分離純化及其多克隆抗體的制備 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2011，35（6）：816-823.