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解偶聯(lián)蛋白嵌合體及突變體的構(gòu)建方法

2013-09-19 05:46:52段秀梅王銀萍沃夫?qū)?/span>格萊爾
關(guān)鍵詞:嵌合體堿基線(xiàn)粒體

王 超,劉 洋,段秀梅,田 莊,王銀萍,沃夫?qū)じ袢R爾,付 彤

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理診斷中心,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科,吉林 長(zhǎng)春 130021;3.奧地利格拉茨醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)與生物化學(xué)研究所,奧地利 格拉茨A-8010;4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院乳腺外科,吉林 長(zhǎng)春 130021)

細(xì)胞內(nèi)的鈣離子(Ca2+)作為第二信使可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)很多生理活動(dòng),如基因轉(zhuǎn)錄、肌肉收縮、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡等。而且,線(xiàn)粒體攝取Ca2+已被證實(shí)對(duì)氧化磷酸化速率[1]、胞漿Ca2+信號(hào)時(shí)空調(diào)控[2]、庫(kù)池調(diào)節(jié)性 Ca2+輸入通道的維持[3]以及凋亡[4]起著非常關(guān)鍵的作用。線(xiàn)粒體Ca2+積存現(xiàn)象及其特征和生理功能已經(jīng)有學(xué)者詳實(shí)報(bào)道[5-6]。然而,Graier等[7-8]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示:解偶聯(lián)蛋白2和3(uncoupling protein 2and uncoupling protein 3,UCP2,UCP3)定位于線(xiàn)粒體兩內(nèi)膜間,屬于線(xiàn)粒體Ca2+輸送體超家族成員,是線(xiàn)粒體Ca2+單一輸送體必要組成部分,并解釋解偶聯(lián)蛋白(UCP)中特定結(jié)構(gòu)決定簇對(duì)線(xiàn)粒體Ca2+攝取的影響取決于鈣離子供應(yīng)的來(lái)源、方式和強(qiáng)度。盡管UCP2、UCP 3作為通道蛋白在線(xiàn)粒體Ca2+積存現(xiàn)象中發(fā)揮的作用機(jī)制還不十分清楚,但其提供了唯一深入闡釋潛在機(jī)制和生理病理作用的可能性。已證明UCP2、UCP3作為線(xiàn)粒體內(nèi)膜間第二環(huán)狀結(jié)構(gòu)(intermembrane Loop 2,IML2)的整體似乎在線(xiàn)粒體攝取Ca2+機(jī)制的功能性上發(fā)揮中樞作用[7],令人感興趣的是UCP家族中相同的結(jié)構(gòu)域能否執(zhí)行相同或相近的功能,如UCP1不會(huì)影響線(xiàn)粒體Ca2+攝取能力。反之,當(dāng) UCP2、UCP3的IML2結(jié)構(gòu)域被UCP1對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)區(qū)域置換,那么UCP2、UCP3是否喪失這種參與Ca2+運(yùn)輸?shù)幕钚陨行柽M(jìn)一步研究。為探討UCP2和UCP3嵌合體及UCP3IML2中第167位精氨酸(R)定向突變?yōu)楦拾彼幔℅)或第171和172精氨酸(R)和谷氨酸(E)定向突變?yōu)?個(gè)甘氨酸(GG)后,是否在線(xiàn)粒體Ca2+攝取不同時(shí)相發(fā)揮關(guān)鍵作用,本研究首次報(bào)道利用重疊延伸拼接(splicing overlap extension,SOE)PCR技術(shù)和定向突變技術(shù)構(gòu)建一組UCPs突變體:UCP1嵌合體即其IML2基因被UCP2蛋白的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因置換,命名為UCP1UCP2;UCP2和UCP3的嵌合體即UCP2和UCP3的IML2基因被相對(duì)應(yīng)的UCP1結(jié)構(gòu)域基因替代,命名UCP2UCP1和UCP3UCP1;克隆突變1個(gè)氨基酸UCP3R167G和突變2個(gè)氨基酸UCP3RE171/172GG的重組質(zhì)粒。本研究旨在通過(guò)制備UCPs嵌合體和突變體方法的介紹,為探討其他蛋白結(jié)構(gòu)功能域的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試 劑 限制性?xún)?nèi)切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ)、T4DNA連接酶、DNA marker、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System、Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System均購(gòu)自Promega公司;Ex Taq DNA Polymerase購(gòu)自TakaRa 公 司;QuikChange ○RXL Site-Directed Mutagenesis Kit購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司;Original TA Cloning○RKit,pcDNA3.1Plasmid購(gòu)自 Invitrogen公司;重 組 質(zhì)粒 pcDNA-UCP1/UCP2/UCP3由格拉茨醫(yī)科大學(xué)Michael Trenker博士惠贈(zèng)。

1.2 UCPs嵌合體引物 根據(jù)GenBank中UCPs mRNA 序 列(UCP1:NM _021833.3;UCP2:NM_003355.2;UCP3:NM_003356.2)設(shè)計(jì)引物序列。

UCP1UCP2: ①5′-AAGAATTCCAGTCTCTGAGTGAAGATGG-3′; ② 5′-TCAAGCCTTCCTCTCGGGCAATGGTCTTGTACGCATTATAAGTCCCCG-3′; ③ 5′-TAATGCGTACAAGACCATTGCCCGAGAGGAAGGCTTGACGGGTCTTTG-3′; ④5′-CCGCTCGAGTTATGTGGCA CAGTCCATAG-3′。

UCP2UCP1:①5′-AAGGTACCATCAGCATCATGGTTGGGTTCAAGG-3′;②5′-GGAACCCTTCGGTTGTTGCTATTATTCTGTAGGCATTGACGGTGCTTT-3′;③5′-CAATGCCTACAGAATAATAGCAACAACCGAAGGGTTCCGGGGCCTCTG-3′; ④5′-AACTCGAGTCAGAAGGGAGCCTCTCGGGAAGTG-3′。

UCP3UCP1:①5′-AAGGTACCCCAGGACTATGGTTGGACTGAAGCC-3′;②5′-TGACTCCTTCGGTTGTTGCTATTATTCTGTAGGCGTCCATAGTCCCGC-3′;③5′-GGACGCCTACAGAATAATAGCAACAACCGAAGGAGTCAGGGGCCTGTG-3′;④5′-AACTCGAGTCAAAACGGTGATTCCCGTAACATC-3′。

每組設(shè)計(jì)2對(duì)引物。克隆引物對(duì)①④,分別取自 UCP1、UCP2、UCP3的 CDS 5′-和3′-編碼區(qū)序列,下劃線(xiàn)者為酶切位點(diǎn)。嵌合引物對(duì)②③,分別取自UCP1、UCP2、UCP3的IML2兩側(cè)的序列,斜體部分為互補(bǔ)的IML2序列,嵌合引物用于將2個(gè)靶片段拼接起來(lái),即UCP1的IML2氨基酸編碼序列162RIIATTE168被UCP2的KTIAREE置換后成 UCP1UCP2嵌合體,UCP2的IML2氨基酸編碼序列164KTIAREE170被UCP1的RIIATTE置換后成 UCP2UCP1嵌合體,UCP3的IML2氨基酸編碼序列167RTIAREE 173被UCP1的RIIATTE置換后成UCP1UCP2嵌合體。

1.3 UCP3定向突變引物 根據(jù)pcDNA-UCP3重組質(zhì)粒序列,用Srtatagene公司網(wǎng)站QuikChange引物設(shè)計(jì)程序軟件,設(shè)計(jì)突變引物序列。UCP3R167G: ⑤ 5′-CTATGGACGCCTACGGAACCATCGCCAGG-3′;⑥5′-CCTGGCGATGGTTCCGTAGGCGTCCATAG-3′。加黑堿基是定向突變的堿基,從UCP3CDS序列起始密碼子至499位點(diǎn)堿基A→G,使167位氨基酸R突變?yōu)镚。UCP3RE171/172GG:⑦5′-CAGAACCATCGCCGGG

GGGGAAGGAGTCAGG-3′; ⑧ 5′-CCTGACTCCTTCCCCCCCGGCGATGGTTCTG-3′。 加 黑 堿基是定向突變的堿基,從UCP3CDS序列起始密碼子至511、515位點(diǎn)堿基A→G,使171、172位氨基酸RE突變?yōu)镚G。

1.4 PCR分別擴(kuò)增UCP1、UCP2及UCP3蛋白IML2兩側(cè)的基因片段 以pcDNA-UCP1/UCP2/UCP3重組質(zhì)粒為模板,分別加入各組的引物①②和③④,擴(kuò)增IML2兩側(cè)基因片段。PCR反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性10min;96℃變性1min,60℃退火1min,72℃延伸50s,35個(gè)循環(huán);72℃終延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。用DNA凝膠提取試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

1.5 SOE-PCR 獲 得 嵌 合 型 UCP1、UCP2 及UCP3基因序列 利用各組引物②③之間的互補(bǔ)序列,可以將UCP1/UCP2/UCP3拼接起來(lái)。以第1次PCR純化產(chǎn)物作為模板。PCR反應(yīng)參數(shù):首次循環(huán),94℃變性45s、37℃退火10min、72℃延伸2min;其余循環(huán),94℃變性45s、57℃退火15s、72℃延伸45s,循環(huán)30次;終延伸72℃、5min。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。用DNA凝膠提取試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。SOE-PCR利用引物②③之間有要拼接的互補(bǔ)序列,把退火溫度降得很低(37℃),使得互補(bǔ)序列之間通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合。在只有引物①④的情況下,即可擴(kuò)增得到嵌合型UCP1、UCP2及UCP3基因。

1.6 SOE-PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序 分別將純化的PCR產(chǎn)物即嵌合型UCP1、UCP2及UCP3基因片段與測(cè)序載體pCR2.1于14℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10涂布于LB培養(yǎng)皿(Kana 50mg·L-1),37℃過(guò)夜培養(yǎng),進(jìn)行藍(lán)白篩選。挑選白色菌落,接種于液體LB培養(yǎng)基(Kana 50mg·L-1),37℃、160r·min-1振蕩過(guò)夜。用質(zhì)粒DNA純化試劑盒提取質(zhì)粒,以其為模板進(jìn)行PCR鑒定,并分別用EcoRⅠ-XhoⅠ(UCP1UCP2)、KpnⅠ-XhoⅠ(UCP2UCP1和UCP3UCP1)進(jìn)行雙酶切鑒定。重組陽(yáng)性克隆pCR-UCP1UCP2、pCR-UCP2UCP1和 pCR-UCP3UCP1進(jìn)行測(cè)序。

1.7 pcDNA-UCP1UCP2、 pcDNA-UCP2UCP1及pcDNA-UCP3UCP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 pCRUCP1UCP2和pcDNA3.1分別用EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切,pCR-UCP2UCP1/pCR-UCP3UCP1和 pcDNA3.1分別用KpnⅠ-XhoⅠ雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,DNA凝膠提取試劑盒分別回收靶序列和線(xiàn)性化的載體,16℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定篩選正確克隆。

1.8 定 向 點(diǎn) 突 變 pcDNA-UCP3R167G/pcDNAUCP3RE171/172GG以 pcDNA-UCP3 重 組 質(zhì) 粒 為 模板,分別加入點(diǎn)突變引物⑤⑥和⑦⑧,用PfuDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性1min;95℃變性50s,60℃退火50s,68℃延伸7min,18個(gè)循環(huán);68℃終延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物中有缺口的環(huán)狀質(zhì)粒和閉合環(huán)狀重組質(zhì)粒模板,用DpnⅠ酶能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)將模板酶切去除,將DpnⅠ處理的PCR產(chǎn)物做轉(zhuǎn)化,再篩選出陽(yáng)性克隆,并提取質(zhì)粒,進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 SOE-PCR獲得UCP1、UCP2及UCP3嵌合型基因序列 利用①②和③④兩對(duì)引物分別獲得UCPs IML2結(jié)構(gòu)兩側(cè)基因片段,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期設(shè)計(jì)的目的基因中包含的堿基數(shù)量吻合UCP1UCP2(637bp,461bp)、UCP2UCP1(544bp,459bp) 及 UCP3UCP1(542bp,464bp)。SOE-PCR利用引物②③之間互補(bǔ)序列通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合使UCPs IML2兩側(cè)基因片段拼接起來(lái),由引物①④可擴(kuò)增得到嵌合型UCP1、UCP2及UCP3基因(圖1)。UCP1的IML2氨基酸編碼序列162RIIATTE168被UCP2的KTIAREE置換后成UCP1UCP2嵌合體,UCP2的IML2氨基酸編碼序列164KTIAREE170被UCP1的RIIATTE置換后成UCP2UCP1嵌合體,UCP3的IML2氨基酸編碼序列167RTIAREE 173被UCP1的RIIATTE置換后成 UCP1UCP2嵌合體(圖2)。

2.2 UCPs嵌合體重組質(zhì)粒的鑒定 pcDNA-UCP1UCP2、pcDNA-UCP2UCP1及 pcDNA-UCP3UCP1重組質(zhì)粒分別用EcoRⅠ-XhoⅠ(UCP1UCP2)、KpnⅠ-XhoⅠ(UCP2UCP1和 UCP3UCP1)進(jìn)行雙酶切鑒定,酶切片段大小均與對(duì)應(yīng)的嵌合型基因長(zhǎng)度一致(圖3)。

圖1 UCP1/UCP2/UCP3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of UCP1/UCP2/UCP3gene

圖2 UCP2和UCP3與UCP1之間的嵌合體基因組成Fig.2 Generation of the chimera between UCP2and UCP3 with UCP1

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA-UCP1UCP2/UCP2UCP1/UCP3UCP1的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pcDNAUCP1UCP2/UCP2UCP1/UCP3UCP1 by enzyme digestion

2.3 定向點(diǎn)突變 UCP3R167G/UCP3RE171/172GG利用定向點(diǎn)突變技術(shù)成功將重組質(zhì)粒pcDNA-UCP3中的UCP3野生型基因第499位點(diǎn)堿基A→G,使167位氨基酸R突變?yōu)镚;第511、515位點(diǎn)的2個(gè)堿基A→G,使171,172位氨基酸R和E突變?yōu)镚和G(圖4)。

圖4 定向突變產(chǎn)生UCP3突變體Fig.4 Mutagenesis of the UCP3mutants

3 討 論

線(xiàn)粒體Ca2+攝取對(duì)于調(diào)節(jié)器官的生理功能和功能障礙是非常重要的[9-10]。線(xiàn)粒體Ca2+通道從功能上已經(jīng)被鑒定,不僅證明在線(xiàn)粒體IMM上有功能的Ca2+通道存在,而且揭示了具有不同特性的線(xiàn)粒體Ca2+通道的存在,這個(gè)觀點(diǎn)挑戰(zhàn)了線(xiàn)粒體上只存在Ca2+單一輸送體的概念。與一些關(guān)于線(xiàn)粒體Ca2+通道功能特性等相反的是線(xiàn)粒體Ca2+通道蛋白至今還沒(méi)最終定論性鑒定。近年來(lái)有研究[11-12]報(bào)道:在未經(jīng)刺激的細(xì)胞中 UCP2/3對(duì)線(xiàn)粒體的Ca2+積累有重要作用,這些蛋白或者作為線(xiàn)粒體Ca2+選擇性離子通道傳導(dǎo)亞單位,或者發(fā)揮線(xiàn)粒體Ca2+攝取通路中必需調(diào)節(jié)子的功能[13]。UCP2/UCP3蛋白對(duì)線(xiàn)粒體攝取Ca2+機(jī)制方面發(fā)揮重要功能性作用的結(jié)構(gòu)組成就是IML2結(jié)構(gòu),然而這個(gè)結(jié)論也備受爭(zhēng)議。要揭示UCP2/3依賴(lài)的線(xiàn)粒體Ca2+單向運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵因素還要取決于實(shí)驗(yàn)操作和模型的選擇[7]。所以,構(gòu)建 UCP2/UCP3與UCP1之間互相置換IML2的嵌合體和UCP3定向點(diǎn)突變體,從分子結(jié)構(gòu)水平上闡釋UCP2/3是線(xiàn)粒體Ca2+單一輸送體的必要組成具有重要意義。

本研究成功構(gòu)建了UCPs嵌合體重組真核表達(dá)質(zhì) 粒(pcDNAUCP1UCP2、pcDNAUCP2UCP1和pcDNAUCP3UCP1)和突變體重組真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-UCP3R167G/pcDNA -UCP3RE171/172GG)。 利用SOE-PCR獲得嵌合型UCP1、UCP2、UCP3基因序列。SOE-PCR的原理:由3個(gè)PCR構(gòu)成,第一階段的PCR產(chǎn)物作為第二階段的PCR模板。產(chǎn)生每個(gè)UCP嵌合基因的SOE-PCR過(guò)程中都需要2對(duì)引物:1對(duì)克隆引物(①④),1對(duì)嵌合引物(②③)。根據(jù)要拼接的2條已知的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)嵌合引物,使得引物②的5′端含有一段UCPs IMM下游5′端的互補(bǔ)序列,而引物③的5′端含有一段UCPs IMM上游3′端的序列。嵌合引物②③中都包含一段需置換的IMM基因序列。這樣嵌合引物引物②的5′端和嵌合引物③的3′端就含有一段互補(bǔ)的序列。在第一階段的PCR中,UCPs IMM上游的PCR產(chǎn)物的3′端帶有UCPs IMM下游5′端的一段序列,同理UCPs IMM下游的PCR產(chǎn)物的5′端帶有UCPs IMM上游3′端的一段序列。因此每種PCR產(chǎn)物的拼接點(diǎn)上都含有另一個(gè)PCR產(chǎn)物的序列。這樣在第二階段的PCR中,當(dāng)這2種PCR產(chǎn)物混合,作為模板時(shí)就能夠部分退火結(jié)合,再使用1對(duì)克隆引物①④,就能形成完整的嵌合型UCPs的基因序列。

當(dāng)使用普通Taq酶作為第一階段PCR的反應(yīng)酶時(shí),其PCR產(chǎn)物的3′端總是多出一個(gè)腺嘌呤核苷酸,即A。這樣在第2階段的PCR反應(yīng)中,就很容易產(chǎn)生堿基的移位,最終導(dǎo)致氨基酸讀碼框的改變,出現(xiàn)蛋白變異。解決這一問(wèn)題的方法是采用具有3′外切糾錯(cuò)功能的ExTaq酶。在第2階段的PCR反應(yīng)中,當(dāng)含有互補(bǔ)序列的2條單鏈低溫退火結(jié)合時(shí),ExTaq酶可切除其3′端突出的A,保證拼接序列具有正確的讀碼框。SOE-PCR是1種多重的PCR擴(kuò)增,拼接產(chǎn)物的合成至少要經(jīng)過(guò)兩重的PCR反應(yīng)。易發(fā)生堿基的錯(cuò)配,導(dǎo)致氨基酸的突變。ExTaq酶不僅具有3′外切糾錯(cuò)功能,還有較高的保真性。因此在整個(gè)的SOE-PCR過(guò)程中,都采用了該酶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:使用ExTaq酶的效果較好,測(cè)序結(jié)果顯示未產(chǎn)生堿基的突變。

利用定向突變的方法獲得帶有1和2個(gè)氨基酸突變的UCP3突變體。首先設(shè)計(jì)1對(duì)突變引物,這種突變引物都是以要突變的堿基為中心,加上兩邊的一段序列,兩邊長(zhǎng)度至少為11~12bp。若兩邊引物太短,很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗。那么,以pcDNA-UCP3重組質(zhì)粒為模板,經(jīng)PCR可把整個(gè)質(zhì)粒都給擴(kuò)增出來(lái),得到的PCR產(chǎn)物是兩條帶有缺口的互補(bǔ)鏈,此時(shí)PCR產(chǎn)物中混有模板,再用DpnⅠ酶去掉模板,DpnⅠ能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切,本研究用的模板重組的pcDNA3.1是雙鏈超螺旋質(zhì)粒,從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(lái)(除非是甲基化缺陷型的菌株),而PCR產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的,所以DpnⅠ酶能夠特異性地切割模板(質(zhì)粒)而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物,從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物,所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株,然后直接把通過(guò)DpnⅠ處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,篩選陽(yáng)性克隆,并提取質(zhì)粒,進(jìn)行測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。需要強(qiáng)調(diào)一點(diǎn),DpnⅠ處理的時(shí)間需長(zhǎng)些,最好消化2~3h,因?yàn)槿绻0逄幚淼貌桓蓛?,殘留的模板就?huì)在平板上長(zhǎng)出來(lái),導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。進(jìn)行這種定點(diǎn)突變PCR需要用高保真Pfu DNA聚合酶,這樣的酶具有3′到5′外切酶(校正)活性。當(dāng)聚合反應(yīng)發(fā)生堿基錯(cuò)配時(shí),聚合酶的校正活性可將錯(cuò)配的堿基切除,擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物為平端,3′端不帶有A堿基,避免造成插入突變。

通過(guò)上述方法得到UCPs突變體,采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù),以轉(zhuǎn)染UCPs嵌合體、突變體重組真核表達(dá)質(zhì)粒的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為模型測(cè)定線(xiàn)粒體Ca2+,證實(shí) UCP2/3的IML2結(jié)構(gòu)域?qū)€(xiàn)粒體Ca2+積聚現(xiàn)象的影響發(fā)揮重要作用(另文已發(fā)表)[14],尤其由 UCP2/3組成的線(xiàn)粒體攝取 Ca2+機(jī)制或是來(lái)自細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放或來(lái)自胞外Ca2+,IML2中2個(gè)不同分子位點(diǎn)對(duì)于Ca2+敏感性至關(guān)重要,這些發(fā)現(xiàn)與線(xiàn)粒體Ca2+單輸送體對(duì)Ca2+有著不同敏感性的報(bào)道是一致的。因此,構(gòu)建解偶聯(lián)蛋白功能結(jié)構(gòu)域的嵌合體和突變體,對(duì)于理解UCP2/3依賴(lài)的線(xiàn)粒體Ca2+攝取的分子機(jī)制以及深入了解UCP2/3對(duì)線(xiàn)粒體Ca2+積聚現(xiàn)象的作用機(jī)制具有重大意義。

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