莫利明 虞 成 楊 攀 王清波 馬 霄

髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是人體一種重要的含鐵溶酶體。目前研究發(fā)現(xiàn)，MPO與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性有相當(dāng)密切的關(guān)系，血液中MPO的增高與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定相關(guān)[1-3]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂是多數(shù)急性冠狀動(dòng)脈綜合癥(acute coronary syndrome，ACS)的病理基礎(chǔ)[4]。因此，及時(shí)對(duì)人體血液中的MPO進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于有效預(yù)防ACS具有十分重要的意義[5-8]。

1 髓過(guò)氧化物酶便攜式檢測(cè)系統(tǒng)

目前，國(guó)內(nèi)外尚未見便攜式MPO髓過(guò)氧化物酶檢測(cè)設(shè)備的報(bào)道。本系統(tǒng)設(shè)計(jì)是基于電化學(xué)理論，通過(guò)對(duì)于MPO生物傳感器的研發(fā)，采用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)等多種特異電壓下可獲得的MPO濃度相關(guān)的機(jī)制，開發(fā)出MPO便攜式檢測(cè)系統(tǒng)[9-10]。實(shí)驗(yàn)研究表明，本系統(tǒng)具有便攜式檢測(cè)MPO的能力，可作為電化學(xué)原理檢測(cè)的便攜式檢測(cè)的平臺(tái)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

1.1 MPO便攜式檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)

MPO的檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，采用16位微處理器作為系統(tǒng)控制模塊，檢測(cè)前端采用三電極電化學(xué)體系實(shí)現(xiàn)，通過(guò)特定的三電極電路、差分放大電路、程控放大電路、抬壓電路等構(gòu)成微弱信號(hào)放大檢測(cè)，達(dá)到滿足MPO生物傳感器電化學(xué)呈高阻抗特征的要求，MPO的濃度特性是通過(guò)特異電壓下不同的電流進(jìn)行表征響應(yīng)而體現(xiàn)反映。由于電化學(xué)機(jī)制的特殊性，需要通過(guò)軟件的計(jì)算方法處理得到最終被測(cè)濃度的相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2 MPO便攜式檢測(cè)系統(tǒng)硬件系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)

本系統(tǒng)采用TI公司的16位MCU微處理器控制作為核心控制芯片，DA模塊選擇TI公司16位電壓輸出型數(shù)模轉(zhuǎn)換器DAC8831，使用AD8571芯片完成微信號(hào)采集，LCD顯示模塊為12864G-189F液晶模塊，硬件系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.3 MPO便攜式檢測(cè)系統(tǒng)硬件系統(tǒng)的工作原理

圖1 MPO便攜式檢測(cè)系統(tǒng)硬件系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框圖

在系統(tǒng)軟件的控制下由微處理器控制器根據(jù)測(cè)試要求發(fā)送一組輸出電壓數(shù)據(jù)給DA模塊，DAC8831數(shù)模根據(jù)MCU微處理器傳出的電壓數(shù)據(jù)，精確輸出一組輸出特定電壓施加至MPO生物傳感器的工作電極，經(jīng)被測(cè)MPO濃度影響生物傳感器獲得其特定表征的響應(yīng)(MPO生物傳感器測(cè)試技術(shù)另有論文專著)，差分放大電路從MPO生物傳感器的工作電極獲得一組含有被測(cè)MPO濃度響應(yīng)特征的微電流信號(hào)，經(jīng)過(guò)差分放大、程控增益控制完成對(duì)微信號(hào)的放大，經(jīng)過(guò)電平處理最終將信號(hào)輸入MCU微處理器A/D輸入端口，完成檢測(cè)數(shù)據(jù)的采集工作，軟件程序?qū)⑿盘?hào)進(jìn)行采樣存儲(chǔ)，并通過(guò)相應(yīng)算法進(jìn)行處理和計(jì)算，并將最終的結(jié)果顯示在液晶屏上，實(shí)現(xiàn)計(jì)算MPO濃度的目標(biāo)。

2 MPO生物傳感器的檢測(cè)原理及檢測(cè)三電極系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

MPO生物傳感器的設(shè)計(jì)采用雙納米材料技術(shù)對(duì)絲網(wǎng)印刷電極的層層修飾和優(yōu)化，將髓過(guò)氧化物酶抗體固載到電極表面，從而獲得一種新型的對(duì)于MPO特定敏感的生物傳感器電極，方法是在絲網(wǎng)印刷電極(SPE)上層層修飾上多壁碳納米管(MWNTs)與納米金(Nano-Au)，利用納米金固載髓過(guò)氧化物酶抗體(anti-MPO)后用BSA封閉納米金上非特異位點(diǎn)，構(gòu)建了一種用于MPO檢測(cè)的新型電流型免疫傳感器，然后采用CV等多種方法對(duì)修飾過(guò)程進(jìn)行表征檢測(cè)獲得MPO的相關(guān)濃度信息數(shù)據(jù)[11-14]。

MPO生物傳感器的檢測(cè)原理是基于電化學(xué)分析中的三電極體系而設(shè)計(jì)開發(fā)。三電極體系優(yōu)于傳統(tǒng)的兩電極體系。電極結(jié)構(gòu)包括工作電極(WE)、參比電極(RE)和對(duì)電極(CE)。參比電極用來(lái)定點(diǎn)位零點(diǎn)，電流流經(jīng)工作電極和對(duì)電極工作電極和參比電極構(gòu)成一個(gè)不通或基本少通電的體系，利用參比電極電位的穩(wěn)定性測(cè)量工作電極的電極電勢(shì)。工作電極和輔助電極構(gòu)成一個(gè)通電的體系，用來(lái)測(cè)量工作電極通過(guò)的電流。利用三電極測(cè)量體系研究工作電極的點(diǎn)位和電流的關(guān)系。本系統(tǒng)采用AD8571芯片完成三電極測(cè)量功能，其輸入偏執(zhí)電流為20～70 pA，輸入偏執(zhí)電壓為1 μV，共模抑制比達(dá)到120～140 dB，可滿足本設(shè)計(jì)對(duì)于I/V轉(zhuǎn)換輸入級(jí)的性能要求。設(shè)計(jì)跨接電容用于濾除環(huán)境中的50 Hz干擾。

3 可編程數(shù)字模擬轉(zhuǎn)換器(DAC)電壓源控制電路

可編程電壓源控制模塊主要用于電流型免疫傳感器檢測(cè)，當(dāng)進(jìn)行CV等多種方式檢測(cè)時(shí)需要提供可編程控制電壓源。本設(shè)計(jì)采用TI公司的16位電壓輸出型數(shù)模轉(zhuǎn)換器DAC8831，具有轉(zhuǎn)換速度快、超低功耗(最低15 μW)、高精度(DAC8831ICD最大線性誤差≤±1 LSB)、a.jpg低輸出噪聲、高速SPI接口(最高可達(dá)50 MHz)、上電自動(dòng)校零等優(yōu)勢(shì)，為了使數(shù)模轉(zhuǎn)換芯片的輸出更加穩(wěn)定，對(duì)DAC8831芯片的基準(zhǔn)源選用低溫溧、高精度和高穩(wěn)定性，通用基準(zhǔn)源芯片TL431，溫漂系數(shù)基本可達(dá)到20～30 ppm/℃。

4 信號(hào)放大電路設(shè)計(jì)

由于所檢測(cè)到的是微電流信號(hào)，需經(jīng)過(guò)一定的放大后才適合A/D采集，本設(shè)計(jì)采用的放大電路是由差分放大電路、程控放大電路、后級(jí)濾波及放大電路組成。

差分放大電路必須設(shè)計(jì)有足夠高的共模抑制比和穩(wěn)定的放大性能，本系統(tǒng)采用opa2277芯片可以有效地保證電路穩(wěn)定工作，達(dá)到完成前置信號(hào)放大的設(shè)計(jì)要求。

本設(shè)計(jì)為了適應(yīng)多種檢測(cè)對(duì)象的需要，采用了可變放大倍數(shù)的電路以利于系統(tǒng)功能的擴(kuò)展。選用BURR-BROWN公司的PGA202芯片，其內(nèi)部集成了程控的增益改變邏輯電路，放大倍數(shù)穩(wěn)定精確，為后續(xù)的數(shù)據(jù)處理提供了方便。程控放大電路設(shè)計(jì)的放大倍數(shù)根據(jù)系統(tǒng)特性進(jìn)行選擇，最終信號(hào)放大至2 V左右，可滿足A/D采樣要求。

5 微處理器控制部分

本系統(tǒng)微處理器控制部分采用TI公司16位控制處理器MSP430F449芯片，這是一種中低端的單片機(jī)，具有2 K字節(jié)的RAM，60 K字節(jié)的FLASH，48個(gè)I/O口，3個(gè)16位定時(shí)器，1個(gè)“看門狗”定時(shí)器，2個(gè)串行通訊口，1個(gè)集成LCD驅(qū)動(dòng)模塊，1個(gè)模/數(shù)轉(zhuǎn)換模塊(ADC12)，1個(gè)16位的硬件乘法器，運(yùn)用非常靈活，同時(shí)具備功耗低、存儲(chǔ)容量大、集成度高及在線支持性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有極高性價(jià)比。MSP430F449在本系統(tǒng)完成整個(gè)軟件程序的運(yùn)行、D/A控制、放大控制、A/D轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理以及LCD顯示模塊驅(qū)動(dòng)等工作。

6 系統(tǒng)軟件程序流程

本系統(tǒng)研制的MPO便攜檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)IAR System集成開發(fā)環(huán)境進(jìn)行軟件設(shè)計(jì)，編程通過(guò)C語(yǔ)言實(shí)現(xiàn)，其核心程序的流程圖如圖2所示。

圖2 MPO便攜式檢測(cè)系統(tǒng)程序流程圖

系統(tǒng)上電后程序先關(guān)閉“看門狗”，對(duì)定時(shí)器、模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊、液晶屏以及微處理器各個(gè)管腳進(jìn)行初始化定義，隨后等待按鍵信號(hào)。啟動(dòng)測(cè)量，即按下按鍵后，程序通過(guò)改變微處理器MSP430F449一系列管腳的電平輸出來(lái)驅(qū)動(dòng)數(shù)模轉(zhuǎn)換芯片DAC8831，使其依照不同的檢測(cè)模式循環(huán)輸出特定電壓，用于三電極系統(tǒng)的電化學(xué)反應(yīng)。通過(guò)定時(shí)器中斷程序來(lái)調(diào)用微處理器自帶的模數(shù)轉(zhuǎn)換功能，對(duì)硬件電路最終輸出信號(hào)進(jìn)行采樣并儲(chǔ)存于寄存器中。在完成預(yù)先設(shè)定的電壓輸出循環(huán)次數(shù)后依照不同的檢測(cè)模式，采用不同的算法對(duì)模數(shù)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和計(jì)算，最終得到被檢測(cè)液體中MPO的濃度結(jié)果。根據(jù)濃度結(jié)果調(diào)用液晶程序查表得到每位數(shù)字的點(diǎn)陣數(shù)據(jù)，并將最終結(jié)果顯示于液晶屏幕上。經(jīng)過(guò)這樣的軟件處理流程完成MPO濃度數(shù)據(jù)的計(jì)算和顯示。

數(shù)字模擬轉(zhuǎn)換器(DAC)控制程序如下：

7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)試。利用CV對(duì)傳感器響應(yīng)電流及所制得的納米物質(zhì)進(jìn)行表征，測(cè)試采用經(jīng)典三電極體系，即MPO抗體修飾的SPE為工作電極，以Ag/AgCl電極為參比電極，導(dǎo)電銀軌(碳漿附著)為對(duì)電極，在含5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/LPBS溶液(pH=7.0)緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(電壓范圍：-0.2～0.8 V；掃描速度：50 mV/s)，所有的測(cè)試緩沖液溫度均在30 ℃下進(jìn)行。該緩沖液提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，用于觀察電流變化。

(2)參照。由于需要校準(zhǔn)抬壓及輸出電壓/輸入電阻比例，使用10 K精密電阻(0.1%)進(jìn)行校準(zhǔn)。將掃描電壓通過(guò)10 K電阻連接到工作電極(如圖3所示)。

圖3 實(shí)驗(yàn)裝置測(cè)試結(jié)果曲線

8 結(jié)論

本研究課題采用雙納米材料技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)以及微處理機(jī)技術(shù)，研制了一種新型的一次性MPO免疫傳感器及便攜式電化學(xué)檢測(cè)裝置。該裝置為使用者提供了一個(gè)人體血液MPO檢測(cè)設(shè)備和電化學(xué)檢測(cè)平臺(tái)，具有特異性好、便攜式等特點(diǎn)。經(jīng)樣機(jī)測(cè)試試驗(yàn)，該便攜式硬件檢測(cè)系統(tǒng)達(dá)到預(yù)期的設(shè)計(jì)技術(shù)要求。目前，該裝置在生物傳感器紙片制作工藝方面有待進(jìn)一步改進(jìn)，以提高其測(cè)試數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及抗干擾的性能，使該裝置的檢測(cè)數(shù)據(jù)更加符合臨床檢測(cè)要求。

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