龐金虎 盛晉華 張雄杰

(1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019;2．內(nèi)蒙古天際綠洲特色生物資源研發(fā)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

肉蓯蓉(Cistanche desertiola Y．C．Ma)是以內(nèi)蒙古自治區(qū)為代表的西北地區(qū)獨(dú)具特色的優(yōu)勢(shì)藥材，為列當(dāng)科肉蓯蓉屬多年生的專性根寄生植物［1］，同時(shí)也是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，并被《國(guó)際野生植物保護(hù)名錄》收入［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，肉蓯蓉在增強(qiáng)免疫力、補(bǔ)腎壯陽、益精血、潤(rùn)腸通便、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及抗氧化、衰老等方面具有不可替代的作用［3－5］。它是使用頻率最高的補(bǔ)腎中藥，有“沙漠人參”之美譽(yù)［6］。

本文以內(nèi)蒙古阿拉善盟阿左旗人工栽培的肉蓯蓉為研究對(duì)象，對(duì)不同生長(zhǎng)年限和采收季節(jié)肉蓯蓉有效成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，以期探索肉蓯蓉最佳采收年限與采收季節(jié)，保證肉蓯蓉有效成分的穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

美國(guó)Waters e2695高效液相色譜儀，Waters二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站;ME5型電子分析天平(德國(guó)sartorius公司)，中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DHG－9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1．2 試藥

甲醇為色譜純(Promptar Company Ltd．)，甲酸為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水。對(duì)照品松果菊苷和毛蕊花糖苷均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為:MUST－11052403和MUST－10012401。

實(shí)驗(yàn)中所用肉蓯蓉藥材采于內(nèi)蒙古阿拉善盟阿左旗肉蓯蓉種植基地，經(jīng)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院盛晉華教授鑒定。

圖1 對(duì)照品與供試品HPLC圖

2 方法與結(jié)果

2．1 松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量測(cè)定

2．1．1 色譜條件:色譜柱為 Apollo C18(4．6mm ×250mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇～0．1%甲酸梯度洗脫，按甲醇～0．1%甲酸(26．5∶73．5)，保持 min，3 min 內(nèi)，換成．5∶70．5，保持 min，流速．8 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)nm;柱溫31℃;理論塔板數(shù)按松果菊苷峰計(jì)不低于12000。見圖1。

2．1．2 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取松果菊苷和毛蕊花糖苷對(duì)照品1．405mg，1．009 mg，置5mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成含松果菊苷、毛蕊花糖苷0．281mg·mL－1，0．2018mg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2．1．3 供試液的制備:取肉蓯蓉藥材粉末(過五號(hào)篩)1．0g，置100 mL燒瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定重量，浸泡30 min，超聲(250 W，35 kHz)處理40 min，取出，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，靜置，取上清液用0．45μm微孔濾膜濾過，濾液置液相進(jìn)樣瓶中。

2．1．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:精密吸取對(duì)照品溶液．2、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、30．0、40．0μL，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)、進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，得回歸方程。松果菊苷:Y=1．157X+218．553(r=0．9999，n=9)，線性范圍0．06～11．24 μg;毛蕊花糖苷:Y=1．767X －50．611(r=0．9999，n=9)，線性范圍．04 ～8．07 μg。

2．1．5 精密度試驗(yàn):取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定峰面積，松果菊苷峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0．30%和2．56%，毛蕊花糖苷峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0．22%和1．31%，表明儀器精密度良好。

2．1．6 穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別在0、8、16、24、48h測(cè)定峰面積，松果菊苷峰和毛蕊花糖苷峰保留時(shí)間和峰面積的 RSD 分別為．31%，0．32% 和．27%，0．83%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．1．7 重現(xiàn)性試驗(yàn):稱取同批樣品6份，按上述方法測(cè)定，松果菊苷峰和毛蕊花糖苷峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為．43%，0．53%和．38%，0．44%，表明重現(xiàn)性良好。

2．1．8 回收率試驗(yàn):取已測(cè)定量的肉蓯蓉樣品1．0 g共6份分兩組，精密加入松果菊苷對(duì)照品溶液(0．2218mg·mL－1)和毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液(0．2357mg·mL－1)2、4、6 mL，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。松果菊苷的平均回收率為99．37%，RSD為1．56%;毛蕊花糖苷的平均回收率為．13%，RSD 為1．15%。

2．2 不同生長(zhǎng)年限對(duì)肉蓯蓉有效成分的影響

以采集的不同生長(zhǎng)年限肉蓯蓉為樣品(個(gè)體長(zhǎng)度皆大于25cm)，經(jīng)切制(切片厚度為0．5～1cm)和80℃烘干至恒重后，粉碎，過五號(hào)篩以待用。按2．1．1色譜條件和2．1．3方法制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算含量。測(cè)定樣品中每根個(gè)體肉蓯蓉中有效成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，取平均值，即得樣品中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。由表1可見，經(jīng)方差分析，不同生長(zhǎng)年限下肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量均達(dá)極顯著水平，F(xiàn)值分別為14．8和18．2。3年生及多年生肉蓯蓉中兩種有效成分含量最高。SSR多重比較結(jié)果:3年生肉蓯蓉的松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量分別為12．08mg·g－1和19．24mg·g－1，與多年生的2種有效成分含量分別為12．46mg·g－1和．32mg·g－1無顯著差異，都極顯著高于 年生、1年生和半年生的2種有效成分含量。

表1 不同生長(zhǎng)年限肉蓯蓉中有效成分的含量(mg·g－1)

2．3 不同采收季節(jié)對(duì)肉蓯蓉有效成分的影響

以春季和秋季采收的肉蓯蓉為樣品(個(gè)體長(zhǎng)度均大于25cm)，按照上述方法測(cè)得樣品中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。經(jīng)方差分析后得，不同采收季節(jié)肉蓯蓉的松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量均達(dá)極顯著水平，表2可見，F(xiàn)值分別為6．7和7．3。秋季采收肉蓯蓉的2種有效成分高于春季采收。SSR多重比較結(jié)果:秋季采收肉蓯蓉中的松果菊苷和毛蕊花糖苷含量分別為6．35mg·g－1和5．47mg·g－1，極顯著高于春季采收肉蓯蓉的2種有效成分分別為3．12mg·g－1和．41mg·g－1。

表2 不同采收季節(jié)肉蓯蓉中有效成分的含量(mg·g－1)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中多次探索流動(dòng)相，最終選定流動(dòng)相甲醇－0．1%甲酸溶液(29．5∶70．5)的保持時(shí)間為27min，可確保松果菊苷與毛蕊花糖苷這兩種成分的峰形較好、基線平穩(wěn)，雜質(zhì)峰出現(xiàn)的較少。

本研究得出:秋季采收的肉蓯蓉有效成分明顯比春季采收的高。對(duì)不同生長(zhǎng)年限肉蓯蓉的有效成分含量分析結(jié)果表明，肉蓯蓉有效成分隨著生長(zhǎng)年限增加而增多，生長(zhǎng)年限達(dá)3年及以上的肉蓯蓉的有效成分含量較高。因此，建議肉蓯蓉的適宜采收時(shí)間應(yīng)在3年以上，秋季采收。

［1］馬毓泉．內(nèi)蒙古肉蓯蓉屬訂正［J］．內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)．1977，1:69 －75．

［2］傅立國(guó)．中國(guó)珍稀瀕危植物［M］．上海:上海教育出版社，1989∶250．

［3］李 媛，宋媛媛，張洪泉．肉蓯蓉的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］．中國(guó)野生植物資源，2010，29(1):7－11．

［4］鄔利婭·伊明，王曉雯，阿斯亞·拜山伯，等．肉蓯蓉總苷對(duì)60Co照射損傷小鼠T淋巴細(xì)胞功能的影響［J］．新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26(6):558－560．

［5］木合布力·阿布力孜，毛新民，熱娜·卡斯本，等．肉蓯蓉總苷在HL－60細(xì)胞中的抗氧化活性研究［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(3):362－364．

［6］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:142．